DNA-extractie uit staartclip: een methode die wordt gebruikt bij het genotyperen van zebravissen

Samenvatting

Bron: Xing L., et al. Snelle en efficiënte zebravis genotypering met behulp van PCR met hoge resolutie smeltanalyse. J.Vis. Exp. (2014).

Dit artikel beschrijft DNA-extractie uit zebravisstaartclip. Het protocol demonstreert een snelle en efficiënte methode om zebravis genotypen te analyseren.

Protocol

1. DNA-voorbereiding

1. Bereid DNA-lysisbuffer voor: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Voeg verse Proteinase K toe aan een eindconcentratie van 1 mg/ml op de dag van gebruik.
2. Weefselverzameling:
   1. Voor volwassen visvin clip:
      1. Verdoof de vis: Plaats de vis in 0,004% MS-222 (tricaine) oplossing. Wacht tot de kieuwbeweging vertraagt.
      2. Leg vis op een stapel van 5-10 Kimwipes en snijd een klein stukje van de staartvin, ongeveer 2-3 mm, met een steriel scheermesje.
      3. Plaats de vis snel in een gelabelde tank met zoet water voor herstel; etiketteer zorgvuldig zowel de tank als de bijbehorende buis die de vinclip bevat. Ververs het water en voer de vis om de andere dag.
      4. Pak de vinklem op met een steriele pipetpunt en breng deze over in een buis gevuld met 100 μl DNA-lysisbuffer.
      5. Gooi de pipettip weg en gooi het scheermesje weg in een scherpe container.
   2. Voor embryo staart clip:
      1. Plaats embryo's in 0,004% MS-222 (tricaïne) oplossing. Wacht 2 minuten.
      2. Snijd een stuk staart met een tang onder een ontledende microscoop.
      3. Doe de staart in een gelabelde buis gevuld met 30 μl DNA-lysisbuffer.
      4. Doe het embryo snel in een buis met 100 μl 4% paraformaldehyde.
      5. Etiketbuizen met embryo's en de bijbehorende staartbuizen.
      6. Bewaar de buisjes met embryo's 's nachts bij 4 °C voor fixatie.
      7. Reinig de tang met Milli-Q water en Kimwipes tussen elk embryo om besmetting te minimaliseren.
   3. Voor hele embryo's:
      1. Plaats embryo's in 0,004% MS-222 (tricaïne) oplossing. Wacht 2 minuten.
      2. Doe 1-5 embryo's in een buis gevuld met 100 μl DNA-lysisbuffer. Dechorionatie is niet nodig.
3. DNA-spijsvertering
   Incubeer buizen met weefsel (vin- of staartclips of embryo's) bij 55 °C gedurende 4 uur tot 's nachts.
4. Inactiveer de Proteinase K
   Warmtebuizen tot 95 °C gedurende 15 min. DNA moeten onmiddellijk voor PCR worden gebruikt of maximaal 3 maanden bij -20 °C worden bewaard.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Tricaine
Paraformaldehyde