Light Sheet Microscopie Monstervoorbereiding: Montage van levende zebravisembryo's voor langdurige beeldvorming

Abstract

Bron: Icha J., et al. Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development. J. Vis. Exp. (2016).

Dit artikel beschrijft de monstervoorbereiding voor lichtbladfluorescentiemicroscopie. Het demonstreert ook een methode om levende zebravisembryo's te monteren voor langetermijnbeeldvorming, waardoor lange time-lapse-films van levende embryo's in bijna fysiologische omstandigheden kunnen worden opgenomen.

Protocol

1. Monstervoorbereiding

1. Het bereiden van de Agarose Mix
   1. Smelt 15 min voor het maken van het agarosemengsel één 1 ml aliquot van 1% laag smeltpunt agarose (opgelost in E3 medium) in een verwarmingsblok ingesteld op 70 °C. Zodra de agarose volledig gesmolten is, breng je 600 μl over in een verse tube van 1,5 ml, voeg je 250 μl E3 medium, 50 μl van 0,4% MS-222 en 25 μl vortexed kraalbouillonoplossing toe.
      OPMERKING: Dit maakt 925 μl van het mengsel, terwijl extra 75 μl wordt berekend voor de vloeistof die later samen met de embryo's wordt toegevoegd.
   2. Bewaar de buis in een tweede verwarmingsblok bij 38-40 °C of zorg ervoor dat de agarose zich zeer dicht bij het geleerpunt bevindt voordat u er monsterembryo's in doet.
2. Montage van de embryo's
   1. Neem vijf glazen haarvaten van 20 μl volume (met een zwarte markering, ~1 mm binnendiameter) en steek er de bijpassende Teflon tip plungers in. Duw de zuiger door het capillair zodat de Teflon-punt zich aan de onderkant van het capillair bevindt.
   2. Breng vijf embryo's (een aantal dat in één keer kan worden gemonteerd) met een glazen of plastic pipet over in de buis van vortexed 37 °C warme agarosemix.
      OPMERKING: Probeer een minimale hoeveelheid vloeistof samen met de embryo's over te dragen.
   3. Steek het capillair in het mengsel en zuig één embryo naar binnen door de zuiger omhoog te trekken. Zorg ervoor dat de kop van het embryo vóór de staart in het capillair komt. Vermijd luchtbellen tussen de zuiger en het monster. Er moet ±2 cm agarose boven het embryo zitten en ±1 cm eronder. Herhaal dit voor de resterende embryo's.
   4. Wacht tot de agarose volledig stolt, wat binnen een paar minuten gebeurt en bewaar de monsters vervolgens in E3-medium, door ze met plasticine of tape aan de muur van een bekerglas te plakken. De onderste opening van het capillair moet vrij in de oplossing hangen, zodat er gas naar het monster kan worden uitgewisseld.
      OPMERKING: Een soortgelijk protocol als de secties 1.1 en 1.2 is ook te vinden op de OpenSPIM wiki pagina http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.

2. Monsterpositionering

1. Monsterhouder montage
   1. Steek 2 plastic hulzen van de juiste maat (zwart) tegen elkaar in de steel van de monsterhouder. Hun spleetkanten moeten naar buiten gericht zijn. Bevestig de klemschroef losjes door deze 2-3 ronden te draaien. Steek het capillair door de klemschroef en duw het door de houder totdat de zwarte kleurband aan de andere kant zichtbaar wordt. Raak de zuiger niet aan.
   2. Draai de klemschroef vast. Duw de overtollige 1 cm agarose onder het embryo uit het capillair en snijd het. Steek de steel in de schijf van de monsterhouder.
   3. Controleer in de software of de microscoopfase zich in de belastingspositie bevindt. Gebruik geleiderails om de hele houder met het monster verticaal naar beneden in de microscoop te glijden. Draai het, zodat de magnetische houderschijf vastklikt.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lightsheet Z.1 microscope	Carl Zeiss Microscopy
Low melting point agarose	Roth	6351.1
Low melting point agarose	Sigma	A4018 or A9414
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/ MS-222/Tricaine)	Sigma	E10521
20 μl (1 mm inner diameter, marked black) capilllaries	Brand	701904	sold as spare part for transferpettor
Teflon tip plungers for 20 μl capillarie	Brand	701932	sold as spare part for transferpettor