1: Twee-foton axotomie met behulp van een op maat gemaakte twee-foton microscoop met een Chameleon Ti-Sapphire laser
- Bereid je voor op beeldvorming. Plaats de gemonteerde embryo('s) op een schuifhouder onder de microscoop. Focus op één embryo met een 40X (0.8 NA) waterdoelstelling. Zet de laser aan. We zijn in staat geweest om GFP-uitdrukkende neuronen reproduceerbaar te visualiseren en te beschadigen met behulp van de volgende parameters. Om axonen op een niet-schadelijk vermogen te visualiseren, stelt u de laser in op een golflengte van 910 nanometer (nm) en een vermogen van 30 milliwatt (mW vermeld is de hoeveelheid vermogen bij het monster). Open de beeldvormingssoftware. We maken gebruik van ScanImage Software ontwikkeld in het laboratorium van Karel Svoboda.
- Druk op focus om het embryo te scannen met de twee-foton laser, lokaliseer het axon dat u wilt axotomiseren en leg een afbeelding van dit axon vast. Markeer de eerste en laatste Z-posities, verkrijg de afbeelding en maak een maximale projectie van de Z-stapels.
- Zoom 70X in op de tak van het axon dat u wilt axotomiseren en stop met scannen. Verhoog de mW bij het monster tot het schadelijke vermogen van 180 mW en voer een enkele scan uit met de laser. Dit doen we door het aantal Z-plakjes in te stellen op 1 en op "Grab" te drukken. Dit moet voldoende zijn om het axon te doorsnijden. Zie discussie voor methoden om deze procedure te optimaliseren voor uw microscoop en experimenteel doel.
- Zoom uit, verminder het vermogen tot 30 mW en maak een foto.
2: Twee-foton axotomie op Zeiss 510 confocale / twee-foton microscoop
- Plaats het gemonteerde embryo op het podium en breng het in beeld met behulp van een 25X waterdoelstelling of een ander geschikt objectief.
- Schakel de lasers met twee fotonen (910 nm) en Argon (488 nm) in een instelling met meerdere sporen in, zodat het mogelijk is om van de ene naar de andere over te schakelen. Hoewel beide lasers worden gebruikt om GFP te detecteren, wordt de tweefotonenemissie gevisualiseerd met rood en de argonlaseremissie met groen om de twee te onderscheiden.
- Gebruik de Argon laser om een axon te identificeren om te verwonden. Markeer onder Z-instellingen de eerste en laatste optische secties. Maak een confocale afbeelding en maak een maximale projectie van de Z-stack.
- Kies de regio van het axon om gewond te raken en breng deze regio in beeld. Schakel de Argon-laser uit en schakel de tweefotonlaser in. Scan het monster met het tweefoton met een laserintensiteit van ~ 9% transmissie om er zeker van te zijn dat het axon nog steeds scherp is.
- Klik op de knop "stop" zodat het bijsnijdgereedschap beschikbaar is. Gebruik bijsnijden om in te zoomen op het interessegebied. Meestal zoomen we in op ~70X (zoom kan worden gecontroleerd onder het tabblad "modus"). Wijzig onder het tabblad "kanalen" de intensiteit van het tweefoton van ~9% transmissie naar 15-20% transmissie.
- Om een axon te verbreken activeert u de knop "snelle XY" gedurende ongeveer 1 seconde en drukt u vervolgens op de stopknop om overmatige schade te voorkomen. Het axon moet worden gezien als verspreid puin als de procedure werkte.
- Om ervoor te zorgen dat het axon beschadigd is, schakelt u terug naar de 488 nm Argon-laser, neemt u nog een confocale afbeelding en maakt u een maximale projectie.
