Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: een methode om elektrische eigenschappen van neuronen te bestuderen

Samenvatting

Bron: Roy, B., et al. Patch clamp opnames van embryonale zebravis Mauthner cellen. J. Vis. Exp. (2013).

Dit protocol beschrijft een techniek genaamd whole-cell patch clamp electrophysiology, een methode om elektrische eigenschappen van Mauthner neuronen en andere reticulospinale cellen in zebravisembryo's te bestuderen.

Protocol

1. Patch clamp opname (hele cel modus)

1. Alle opnames worden uitgevoerd in de hele cel patch klem modus. Opnamekamers worden in een elektrofysiologische opstelling op een microscooppodium geplaatst. Onze podia zijn gefixeerd en de rechtopstaande patchklemmicroscoop wordt vastgeschroefd aan een beweegbaar microscoopplatform of een microscoopvertaler.
2. Patchklempipetten worden op een horizontale trekker getrokken (P-97; Sutter Instruments Co.) van dunwandig, borosilicaatglas verkregen uit WPI. Pipetpuntdiameters liggen in de orde van grootte van 0,2-0,4 μm na het polijsten van vuur tot een gladde rand en de schacht taps is ~ 4 mm lang.
3. Bevestig de pipet aan de hoofdtrap van de versterker in de elektrofysiologie-opstelling. Het is belangrijk om het hoofdstadium in een hoek van ongeveer 45° ten opzichte van de horizontale as te houden, omdat dit zorgt voor een ingangshoek voor de pipet die geschikt is voor de vorming van afdichtingen met hoge weerstand op de Mauthner-cel.
4. Breng vlak voor het betreden van de badoplossing een kleine hoeveelheid positieve druk op de pipet aan om de kans op vuil worden van de punt te verminderen. Bij het registreren van mEPSC's omvatten badoplossingen 1 μM TTX om actiepotentiaal te blokkeren, 5 μM strychnine om glycinereceptoren te blokkeren en 10 μM bicuculline of 100 μM picrotoxine om GABAA-receptoren te blokkeren. Bij het registreren van mIPSC's omvatten badoplossingen 1 μM TTX, kynureninezuur en bicuculline of strychnine, afhankelijk van de receptoractiviteit van belang.
5. Benader de M-cel met een kleine hoeveelheid positieve druk in de pipet. De positieve druk duwt de cel voorzichtig van links naar rechts en vormt, wanneer deze direct over de cel wordt geplaatst, een klein kuiltje op het celmembraan. Laat de pipet een paar seconden op zijn plaats zitten om het celoppervlak voorzichtig schoon te maken, zodat een sterke afdichting tussen de pipet en het membraan kan worden gevormd. Het loslaten van de positieve druk in de pipet maakt het mogelijk om de afdichting te starten en een kleine hoeveelheid negatieve druk in combinatie met negatieve pipetpotentiaal resulteert in GigaΩ-afdichtingen die zich binnen een paar seconden vormen.
6. Verander het houdvermogen op de versterker in -60 mV. Breek het celmembraan met een reeks korte zuigpulsen. Registreer onmiddellijk membraanpotentiaal en minimaliseer capaciteitsartefacten. Compenseer celvermogen (Cm) en toegang (serie) weerstand (Ra) met 70-85%. Ra moet routinematig worden gecontroleerd, elke 30 seconden tot een minuut, en als er een verandering van 20% of meer is, breek het experiment dan af.
7. Zodra het experiment is beëindigd en er voldoende gegevens zijn verkregen, wordt het preparaat opgeofferd door de achterhersenen te verwijderen met een tang. Op dit moment kan de gegevensanalyse beginnen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Pipette Puller	Sutter Instruments Co	P-97
Upright Patch clamp microscope	Leica Microsystems	DMLFSA
Amplifier	Molecular Devices	200B
Micromanipulator	Siskiyou Inc.	MX7500