Embryo Microinjection: Een techniek om een verbinding in de Zebrafish Yolk te leveren

Samenvatting

Bron: Sorlien, E. L., et al. Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerde gen knock-outs in het modelsysteem Danio rerio. J. Vis. Exp. (2018).

Deze video beschrijft een techniek van Embryo microinjection om verbindingen in Zebrafish dooierzak te leveren.

Protocol

1. Micro-invoeging van CRISPR-componenten in Zebrafish Embryo's

1. Zet foktanks op de nacht voorafgaand aan het injecteren door het aantal gewenste mannetjes en vrouwtjes (meestal 2 vrouwtjes en 1 of 2 mannetjes) in een kweektank met een scheidingswand op zijn plaats te plaatsen.
2. Bereid een micro-invoegplaat met 1,5% agarose in 1x E3-media (zie tabel met materialen) met 0,01% methyleenblauw (een fungicide) door 35 ml van de gesmolten agarose in een Petrischaal van 10 cm te gieten en leg voorzichtig een plastic mal om wigvormige troggen in de oplossing te maken, waarbij de mal wordt aangetikt om luchtbellen te elimineren.
3. Laat de agarose inzetten en bewaar de schaal met een kleine hoeveelheid media en gewikkeld in paraffinefolie om te voorkomen dat de plaat uitdroogt bij 4 °C.
   OPMERKING: Injectieplaten zijn enkele weken herbruikbaar, totdat de putten vervormd of droog worden of de plaat schimmel begint te groeien.
4. Op de ochtend van injecteren, ontdooi gezuiverd sgRNA en Cas9 eiwit op ijs. Vergeet niet om alle materialen met handschoenen te hanteren om RNase-vervuiling te voorkomen en om RNase-vrije tips en buizen te gebruiken.
5. Genereer een injectieoplossing van 5 μL door Cas9-eiwit en sgRNA te combineren in een 2:1-verhouding van Cas9:sgRNA om eindconcentraties van 400 pg/nL Cas9-eiwit en 200 pg/nL sgRNA te verkrijgen. Incubeer de Cas9/sgRNA-oplossing gedurende 5 minuten op kamertemperatuur zodat de Cas9 en sgRNA een ribonucleoproteïnecomplex kunnen vormen. Voeg 0,5 μL 2,5% wt/vol fenol rode oplossing (zie tabel met materialen)en RNase-vrij water toe aan een eindvolume van 5 μL.
   OPMERKING: Het is aangetoond dat de ionische sterkte van de oplossing van invloed is op de oplosbaarheid van het Cas9/sgRNA-complex, daarom kan de toevoeging van KCl de snijefficiëntie verhogen van sgRNAs die een lage indelvorming vertonen.
6. Maak een injectienaald door een glazen capillair van 1,0 mm te trekken met behulp van een micropipettrekker. Snijd de punt van de vers gemaakte naald met een nieuw scheermesje of tang om een schuine opening te verkrijgen die gemakkelijk het koraal en de dooierzak zal doorboren.
7. Plaats de naald in een micromanipulator die aan een micro-uctor is bevestigd terwijl de luchtbron is ingeschakeld. Stel onder een lichtmicroscoop met behulp van de vergroting die geschikt is voor de kalibratie die voor het betreffende apparaat is bepaald, de injectiedruk in totdat de naald consequent een 1 nL-oplossing in een petrischaal gevuld met minerale olie werpt.
   OPMERKING: De kwaliteit van de naald is van cruciaal belang. Oefen met het produceren van een naald en het injecteren in de dooierzak van embryo's totdat deze vaardigheid onder de knie is voordat u verdere experimenten probeert.
8. Verwijder de verdeler en laat de vis ongeveer 15 minuten broeden.
   OPMERKING: Langere broedtijden zullen meer embryo's produceren, maar de injectie moet worden voltooid terwijl de embryo's zich in het stadium van 1 cel bevinden om de kans te maximaliseren dat Cas9-snijden vroeg zal plaatsvinden en daarom het genetische mozaïek zal verminderen. Embryo's kunnen in latere stadia (2-4 celstadia) worden geïnjecteerd, maar dit kan mogelijk de kiembaantransmissiesnelheid van het gemodificeerde allel verminderen.
9. Verzamel de eieren met een zeef en spoel ze af in een Petrischaaltje van 10 cm met 1x E3 medium met 0,0001% methyleenblauw. Onderzoek de gezondheid van de eieren onder de lichtmicroscoop en verwijder onbevruchte eieren en puin.
10. Zet 10-15 embryo's opzij als een niet-geïnjecteerde controle in een aparte petrischaal met label.
11. Lijn met behulp van een transferpipet de eieren voorzichtig op de injectieplaat die op kamertemperatuur is opgewarmd.
12. Injecteer onder een dissectiemicroscoop bij 2,5X vergroting 1 nL van de oplossing in de dooierzak van elk embryo om in totaal 400 pg Cas9-eiwit en 200 pg sgRNA te injecteren.
    OPMERKING: Om het snijden indien gewenst of noodzakelijk te verhogen, verhoogt u de uiteindelijke concentratie cas9-eiwit tot 800 pg/nL en sgRNA tot 400 pg/nL in de injectieoplossing; dit kan echter ook het buiten het doel snijden verhogen en/of de gezondheid van embryo's verminderen. Snijefficiëntie kan ook worden verhoogd door rechtstreeks in de cel te injecteren. Injectie in de dooierzak is echter technisch minder veeleisend en geeft voldoende snijden om vis te produceren met een hoge kiembaanoverdracht (>70% van de nakomelingen die een gemodificeerd allel bevatten).
13. Breng de geïnjecteerde embryo's terug in een petrischaal met een goed etiket, bedek ze met 1x E3-media met methyleenblauw en plaats ze in een embryo-incubator op 28 °C.
14. Inspecteer na 24 uur na de bevruchting (hpf) de gezondheid van de geïnjecteerde embryo's, verwijder dode of abnormaal ontwikkelende personen en verander de media (zie figuur 1). Controleer de overlevingskans tegen de niet-geïnjecteerde controle.
    OPMERKING: Bij het richten op een niet-essentieel gen wordt minder dan 10% letaliteit verwacht ten opzichte van de niet-geïnjecteerde controle. Als verhoogde niveaus van letaliteit worden waargenomen in de met gids geïnjecteerde populaties in vergelijking met de niet-geïnjecteerde controle, kan dit erop wijzen dat het beoogde gen essentieel is voor de ontwikkeling, of off-target effecten leiden tot mislukte ontwikkeling. Het verminderen van de hoeveelheid geïnjecteerde CRISPR-reagentia kan nodig zijn of het genereren van een nieuw sgRNA met verminderde off-target effecten kan nodig zijn.
15. Breng de embryo's terug naar de incubator en blijf de embryo's kweken tot 72 hpf, en verander dagelijks de media om de gezondheid van het embryo te behouden.

Resultaten

Figuur 1: Vergelijking van de gezondheid van 24 hpf geïnjecteerde embryo's. Een levend embryo (A) ontwikkeld tot 24 hpf, is gemakkelijk te onderscheiden van een embryo dat de ontwikkeling heeft afgebroken (B). Embryo's die lijken op (B) of die drastisch zijn veranderd in (A), zoals kromming van de wervelkolom of veranderde hoofd- en oogontwikkeling, moeten uit de schaal worden verwijderd

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RNase-free water	Any brand		Synthesis of guide RNAs. Thermo<br/> &nbsp;Fisher and Qiagen both carry<br/> &nbsp;suitable water.
E3 embryo media	Made in house		Media for raising embryos and<br/> making injeciton plate.<br/> Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140	Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos.
Petri dish	Thermo Fisher	FB0875711Z	Store embryos, cast injection plate
Agarose	Denville	CA3510-8	Casting injection plate, agarose gels.
Microinection mold	Adaptive Science Tools	TU-1	To create wells to hold embryos during injection
Phenol Red	Sigma-Aldrich	P0290	Dye for visualization of injection
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M5904-5ML	To calibrate needle injection volume.
Transfer pipettes	Any brand		Moving embryos
Razor blade	Thermo Fisher	11295-10	Cutting injection needle, tail clipping adult fish.
Incubator			Maintaining embryos at 28.5 C.
Verticle pipette puller	David Kopf Instruments	700C	Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions:<br/> http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long
Capillary tubes	Sutter Instruments	BF100-58-10	Geneate needles for injection.
Microloader tips	Eppendorf	930001007	Load solution into injection needles
Microinjector	World Precision Instruments	PV 820	Injecting embryos.
Disecting microscope	Leica		Injecting embryos.
Microwave	Any brand		Casting injection plate, agarose gels.
Scale	Any brand		Casting injection plate, agarose gels.
Gloves	Any brand		For all aspects of the protocol.
N2	Any brand		To expell liquid from the capillary for embryo injection
PCR strip tubes	Any brand		For all aspects of the protocol.
200 &micro;L tips	Any brand		For all aspects of the protocol.
10 &micro;L tips	Any brand		For all aspects of the protocol.
Micropipettes	Any brand		For all aspects of the protocol.