Zebravis patiënt-afgeleide Xenograft (zPDX): een kankermodel

Samenvatting

Bron: Wang L. et. al., Patient-derived Heterogene Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment. J.Vis. Exp. (2019).

Deze video beschrijft de techniek om een van zebravispatiënt afgeleid xenograftmodel te maken. In het monsterprotocol beoordelen we de efficiëntie van de geneesmiddelen Gemcitabine en Navitoclax op het xenograftmodel van de pancreastumor.

Protocol

1. Injecteren van gemengde celsuspensie in de zebravis

1. Voeg 10x tricaïneoplossing toe aan E3-water om zebravislarven te verdoven en breng de larven (vanaf stap 2.3) over naar de injectieplaat gevuld met gemodificeerde E3 (E3 met 1 g/L glucose en 5 mmol/L L-glutamine).
2. Vul 25 μL gemengde celsuspensie in de micronaald en steek de naald in de micro-injectiemanipulator.
3. Stel injectiedruk en -tijd in. Injecteer 50-80 cellen (~8 nL) in de dooierzak van 48 hpf zebravis.

2. Cultuur van de Xenografted Zebrafish (zPDX Model)

1. Breng de post-xenografted zebravislarven over in 40 ml mengoplossing (E3-oplossing met 1 g/L glucose en 5 mmol/L L-glutamine) bij 32 °C.

3. Drug Administration op de xenografted zebravis en de beoordeling van tumorcellen / fibroblasten viabilities

1. Bepalen van de optimale concentratie gemcitabine/navitoclax.
   1. Plaats 10 wildtype zebravisembryo's met 48 hpf in elke put van een 12-putplaat.
   2. Voeg verschillende concentraties gemcitabine of navitoclax toe in elke put en incubeer bij 32 °C gedurende twee dagen.
   3. Bereken na 2 dagen de maximale tolerantiedosering (MTD) van gemcitabine en navitoclax waarbij de zebravislarven geen significante misvorming en abnormaal gedrag vertonen en de werkconcentraties onder de MTD worden ingesteld.
2. Behandeling van zPDX-modellen met gemcitabine/navitoclax.
   1. Plaats 10 xenografted larven in elke put van een 12 put plaat.
   2. Verdeel de larven in vier groepen, behandel de controlegroep in E3 met 0,1% DMSO en behandel de andere groepen met 5 μg/ml gemcitabine en/of 50 μM navitoclax en incubeer gedurende twee dagen bij 32 °C.
3. Beoordeling van de cel viabilities en cellulaire samenstelling in zPDX modellen.
   1. Verdoof de xenografted larven na de behandeling en plaats ze in 3% methylcellulose.
   2. mage de larven uit het zijaanzicht met behulp van een fluorescentiemicroscoop of confocale microscoop.
   3. Kwantificeer de intensiteit van rode en groene fluorescentiesignalen met behulp van ImageJ- en GraphPad-software.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
L-glutamine	GIBCO	21051024
Gemcitabine	Gemzan
Methylcellulose	Sigma	M0262
Navitoclax(ABT-263)	Selleck	S1001	Bcl-xL inhibitor
Equipment
Microinjector	NARISHIGE
Confocal Microscope	LEICA	SP8	0.00