Hartdissectie: een methode om zebravis hartontwikkeling te observeren

Samenvatting

Bron: Singleman C. et. al., Heart Disissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio. J.Vis. Exp. (2011).

Deze video beschrijft een techniek om het hart te isoleren van een zebravis in meerdere ontwikkelingsstadia om hartontwikkeling, rijping en veroudering te bestuderen.

Protocol

1. Het meten van vissen en dissectie

1. Plaats enkele vis in petrischaal half gevuld met verse PBS en leg deze op de rechterkant.
2. Meet de lengte van de vis van de snuit tot de basis van de staart (de staartvoet), met inbegrip van staartvinnen, met behulp van een digitale mm-remklauw (figuur 1). Dit is de standaardlengte (SL).
3. Elke vis kan een cijfer/lettercombinatie krijgen om een individuele vis en het resulterende ontlede hart te kunnen volgen voor latere analyse. Gegevens, waaronder het voorraadnummer van de ouders, leeftijd bij fixatie, SL-metingen, werden ingevoerd in een spreadsheet en georganiseerd op basis van deze labels.
4. Vóór dissectie, label PCR buisstrips met toegewezen volgnummer en vul met PBT of een andere oplossing die geschikt is voor verdere analyse.
5. Oriënteer de ventrale kant van de vis omhoog in petrischaal terwijl u het lichaam stabiliseert met een tang die het hoofd tussen de ogen en kieuwen houdt (figuur 1).

Kleinere vissen (kleiner dan 12mm SL):

6. a) Verwijder met behulp van een scherpe tang, of een micronaald in een speldhouder, de borstspieren en vinnen uit het lichaam om het hart te onthullen. De constante beweging van de tang tijdens dissectie kan stromingen in de PBT veroorzaken die de vis bewegen. Dit is vooral problematisch voor kleinere vissen, dus een micronaald kan worden gebruikt om borstspieren en vinnen te verwijderen en de lichaamsholte te openen.
7. a) Gebruik de tang voorzichtig om het hart onder het atrium uit de holte te scheppen. Als alternatief kunt u bij sommige vissen het hart verwijderen door de bolle uit te trekken en de rest van het hart zal volgen. Wees voorzichtig met de locatie van het atrium als u deze techniek gebruikt, omdat deze gemakkelijk kan worden beschadigd. Als er extra weefsel bij het hart hoort, is dat prima en kan het daarna worden opgeruimd.
8. a) Als de vis een fluorescerende hartmarker bevat, zoals Tg(myl7:GFP)^twu34,gebruik dan fluorescerende ruimte voor dissectie en controleer de verwijdering van het hart door florescentie (figuur 2).
9. a) Zodra het hart uit de holte is verwijderd, gebruikt u de tang om het hart vast te houden en een micronaald om extra niet-hartweefsel en de epicardiale voering van de buitenkant van het hart te verwijderen.

Grotere vissen (groter dan 12mm SL):

6. b) Maak met behulp van een microschaar met veerhandgreep drie incisies van minder dan 1 mm diep: 1- dwarsdoorsnede door de kieuwen 2- dwarssnede bij voorbuik 3- sagittale snede aan de ventrale zijde die beide sneden verbindt (figuur 3).
7. b) Verwijder met behulp van een scherpe tang de borstspieren en vinnen uit het lichaam om de lichaamsholte te openen en het zilverachtige weefsel van het hartzakje te onthullen (figuur 4A). Verwijder dit pericardweefsel en het hart wordt zichtbaar (Figuur 4B).
8. b) Gebruik de microschaar om de slagader te snijden die verbonden is met de bolvormige slagader, die zich superieur aan het hart bevindt. Zodra deze slagader is doorgesneden, plaatst u de tangpunten onder het atrium, gebruikt u de tang om het hart uit de holte te scheppen. Als er extra weefsel bij het hart hoort, is dat prima en kan het later worden verwijderd.
9. b) Zodra het hart uit de holte is verwijderd, gebruikt u de twee tangen om het hart vast te houden en extra weefsel te verwijderen, of een paar tangen om het hart vast te houden en een micronaald om extra, niet-hartweefsel te verwijderen. De epicardiale voering, duidelijk door zijn zwarte pigmentatie, kan indien gewenst van de buitenkant van het hart worden verwijderd door het weefsel voorzichtig te schrapen.

Resultaten

Figuur 1. Houd de vis met een tang tussen de ogen en kieuwen.

Figuur 2. Een cardiale specifieke fluorescerende transgene marker zoalsTg(myl7:GFP)^twu34, hier getoond, kan helpen bij het visualiseren van harten ontleed van kleinere vissen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Forceps #55  	Fine Science Tools	11295-51
Micro-scissors 	Fine Science Tools	15005-08
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12
Micro-needles	Fine Science Tools	10130-10
Petri dishes  	BD Biosciences	351029