Dit artikel zal detail het protocol voor het meten van calpaïne activiteit in de vaste en levende cellen met behulp van flow cytometrie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het meten van calpaïne Activiteit in vaste en levende cellen door flowcytometrie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Calpains zijn alomtegenwoordig intracellulaire, calcium-gevoelige, neutrale cysteine proteases
Protocol
Reagentia voor te bereiden
Opmerking: Alle PBS bevat Ca 2 + en Mg 2 +
- Detectie Reagens
Voeg 20μM 7-amino-4-chloormethyl coumarine, t-BOC-Leucine-methionine amide (BOC-LM-CMAC) op kamertemperatuur PBS. Elke cel schorsing vereist 2 ml detectie reagens. - 1% Paraformaldehyde (vaste cellen)
Verdunnen 4% paraformaldehyde stockoplossing bij kamertemperatuur PBS. Aliquot 1 ml 1% paraformaldehyde aan elke FACS buis. Drie FACS buizen zijn nodig voor elke experimentele conditie (ex. 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 nodig 9 FACS buizen) - PD150606 (calpaïne-remmer)
Reconstrue....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De calpaïne activiteit in de vaste en levende cellen 32Dkit is bepaald in deze video protocol. Behandeling van de cel lijn met de calpaïne remmer PD150606 resulteerde in complete remming van calpaïne activiteit in de cellen. Daarnaast is behandeling met de remmer MEK1 PD98059 resulteerde in complete remming van calpaïne activiteit in de cellen. ERK is een belangrijke activator van calpaïne-2 3. Deze resultaten suggereren dat calpaïne-2 activiteit is overheersend in de 32Dkit cellen. Huidige werk in ons labora.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Ondersteund door subsidies van de Canadese Institutes of Health Research, de leukemie en lymfoom Society van Canada en de Stichting Lymfoom van Canada.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde | Invitrogen | Los 4 g paraformaldehyde op in 100 mL PBS. Verwarm het monster in een zuurkast onder roering totdat de oplossing helder is. Laat afkoelen en bewaar vervolgens bij 4 °C°C | |
| PD150606 | Invitrogen | Gebruik vers gereconstitueerd PD150606 voor maximale calpaïne-inhibitie. | |
| PD98059 | Cell Signaling Technology | ||
| AlignFlow, AlignFlow plus fluorescente beads FACS-buisjes | Invitrogen | ||
| LSR II | BD Biosciences | Supernatant van WEHI-3-cellen wordt in deze experimenten gebruikt als bron van IL-3. Elke batch WEHI-3-supernatant wordt getitreerd om de optimale concentratie voor de groei van 32Dkit-cellen te bepalen. |
Referenties
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
