Dit protocol maakt gebruik van een pull-down test om het niveau van de actieve RhoC GTPase vast te stellen in de cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
RhoC GTPase heeft 91% homologie met RhoA GTPase. Omwille van de prevalentie in cellen, hebben veel reagentia en technieken voor het RhoA GTPase ontwikkeld. Echter, is RhoC GTPase uitgedrukt in uitgezaaide kankercellen op relatief lage niveaus. Daarom hebben weinig RhoC-specifieke reagentia ontwikkeld. We hebben een aangepast Rho activatie test om RhoC GTPase op te sporen. Deze techniek maakt gebruik van een GST-Rho bindende domein fusie-eiwit te trekken actief RhoC GTPase. Daarnaast kunnen we totaal eiwit oogsten aan het begin van de test tot het niveau van het totaal (GTP en het BBP gebonden) RhoC GTPase te bepalen. Dit maakt voor de bepaling van actief versus het totaal RhoC GTPase in de cel. Een aantal commerciële versies van deze procedure zijn echter ontwikkeld, zijn de commerciële kits geoptimaliseerd voor RhoA GTPase en meestal niet goed werken voor RhoC GTPase. Delen van de test zijn eveneens gewijzigd als de ontwikkeling van een RhoC-specifiek antilichaam.
Protocol
1. Bereid GST-fusie-eiwit
- Glycerol voorraden JM109 bevoegde bacteriën die de eerste N-terminale 90 aminozuren van de rhotekin Rho bindend domein (RBD) gesubkloneerd in de BamH1/EcoR1 pGEX3x vector worden gemaakt.
Om ervoor te zorgen hoge efficiëntie van de volgende stappen moeten worden uitgevoerd voor elk experiment. In onze ervaring, vers bereide GST-RBD is de sleutel tot een robuuste en accurate GTPase activering assay. - Voeg 50 uL (bij benadering, niet ontdooien) van glycerol voorraad aan 50 ml van LB versterker en groeien 37 ° C gedurende de nacht met schudden.
- Verdunnen 1:10 in 500 ml LB-versterker en groeien gedurende 1 u....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De meest kritische fase van de procedure is de generatie van verse GST-RBD. Gebrek aan aandacht te besteden aan deze stap is de belangrijkste reden voor de mislukking. Alle stappen, van de generatie van de GST-RBD (1.2) op de overnacht incubatie met de cel lysaat (2.5), moet worden gedaan in een enkele dag. Een andere cruciale stap is om er zeker van dat er genoeg cellen om de cellysaten te produceren. Dit is vooral van belang als we kijken naar RhoC GTPase, die de neiging heeft om aanwezig te zijn in lage niveaus in de.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Ministerie van Defensie W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 en W81XWH-08-1 tot 0356
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Glutathion-sepharose 4B beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| Criterion 4-20% Tris-HCl gels | Bio-Rad | 345-0032 |
Referenties
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype. Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
