RhoC GTPase Activering Assay

Samenvatting

Dit protocol maakt gebruik van een pull-down test om het niveau van de actieve RhoC GTPase vast te stellen in de cellen.

Samenvatting

RhoC GTPase heeft 91% homologie met RhoA GTPase. Omwille van de prevalentie in cellen, hebben veel reagentia en technieken voor het RhoA GTPase ontwikkeld. Echter, is RhoC GTPase uitgedrukt in uitgezaaide kankercellen op relatief lage niveaus. Daarom hebben weinig RhoC-specifieke reagentia ontwikkeld. We hebben een aangepast Rho activatie test om RhoC GTPase op te sporen. Deze techniek maakt gebruik van een GST-Rho bindende domein fusie-eiwit te trekken actief RhoC GTPase. Daarnaast kunnen we totaal eiwit oogsten aan het begin van de test tot het niveau van het totaal (GTP en het BBP gebonden) RhoC GTPase te bepalen. Dit maakt voor de bepaling van actief versus het totaal RhoC GTPase in de cel. Een aantal commerciële versies van deze procedure zijn echter ontwikkeld, zijn de commerciële kits geoptimaliseerd voor RhoA GTPase en meestal niet goed werken voor RhoC GTPase. Delen van de test zijn eveneens gewijzigd als de ontwikkeling van een RhoC-specifiek antilichaam.

Protocol

1. Bereid GST-fusie-eiwit

1. Glycerol voorraden JM109 bevoegde bacteriën die de eerste N-terminale 90 aminozuren van de rhotekin Rho bindend domein (RBD) gesubkloneerd in de BamH1/EcoR1 pGEX3x vector worden gemaakt.
   
   Om ervoor te zorgen hoge efficiëntie van de volgende stappen moeten worden uitgevoerd voor elk experiment. In onze ervaring, vers bereide GST-RBD is de sleutel tot een robuuste en accurate GTPase activering assay.
2. Voeg 50 uL (bij benadering, niet ontdooien) van glycerol voorraad aan 50 ml van LB versterker en groeien 37 ° C gedurende de nacht met schudden.
3. Verdunnen 1:10 in 500 ml LB-versterker en groeien gedurende 1 uur
4. Veroorzaken GST-eiwit productie met 0,1 mM IPTG gedurende 2 uur.
5. Gelijkmatig te verdelen in de centrifuge flessen en centrifuge, Sorval GSA3 rotor bij 5000 tpm 4 ° C gedurende 20 minuten.
6. Resuspendeer pellet in centrifuge flessen, 10 ml lysis buffer *.
   * Bacteriële Lysis Buffer: 20% sucrose, 10% glycerol, 50 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM Na ₂ S ₂ O _5, 2 mM MgCl _{2, 2} mM DTT, Add verse PMSF, benzamide, aprotinine en leupeptin.
7. Ultrasone trillingen 2-3 min (dit is afhankelijk van het type ultrasoonapparaat. We maken gebruik van een Fischer Sonic Dismembranator Model 500 vastgesteld op mark 6, 50% cyclus).
8. Centrifuge, Sorvall SS34, 20 min 10.000 rpm bij 4 ° C. Op dit punt een kleine hoeveelheid kan worden genomen en uitgevoerd door SDS-PAGE. De gel kan Coomassie gekleurd zijn en een band moet duidelijk zijn op 46 kDa.
9. Verwijder supernatant en voeg 1 ml van 50% glutatione-Sepharose 4B slurry.
10. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C met rotatie. Was drie keer met lysis buffer.
11. Resuspendeer GST-RBD/glutatione-Sepharose kralen om een ​​50% suspensie (ongeveer 1 ml) met GST-vis buffer **. ** GST-Fish Buffer: 10% glycerol, 50 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-4, 2 mM MgCl _2, Voeg verse PMSF, benzamide, aprotinine en leupeptin

2. GST-fusie pull-down-test

1. Gebruik 50-10 x 10 ⁶ cellen / test
2. Was cellen eenmaal in ijskoud PBS, blijf platen op ijs (we gebruiken een platte glazen schaal gevuld met ijs) en lyseren met 0,5 ml GST-vis buffer.
3. Incubeer 5 min op ijs-, oogst-cellen met behulp van een rubberen politieman of vlak scrapper, transfer naar buis microfuge en 20.000 toeren per minuut 5 min gecentrifugeerd bij 4 ° C.
4. Overdracht supernatant naar een nieuwe microfugebuis. Neem 50 ui van de totale Rho (dat wil zeggen het BBP + GTP gebonden) te bepalen.
5. Voeg 0,5 mL GST-RBD/glutatione-Sepharose kralen en incuberen bij 4 ° C, 's nachts met rotatie.
6. Was 6x met GST-vis buffer.
7. Resuspendeer kralen in 40 ul 2x-Laemelli sample buffer
   Op dit punt van de concentratie van het totale Rho eiwit genomen fractie in 2.4 dient te worden bepaald en 30 ug bereid te worden uitgevoerd op de gel met de corresponderende activering monster.
8. Kook monsters bij 90 ° C gedurende 5 min, kort centrifuge en neem supernatant (dat wil zeggen voorkomen dat de kralen) laden en draaien op een 12-well 4-20% gradiënt SDS-PAGE gel.
9. Run gel op niet hoger dan 150 volt, over te dragen aan membraan met behulp van Towbin buffer en de constante stroom van 100 W.
10. Block membraan met 5% melk / TBST oplossing en sonde met RhoC-specfic antilichaam.

3. Representatieve resultaten

Goede resultaten moet produceren een enkele band op ongeveer 22 kDa. Slechte resultaten produceren meerdere banden of een hoge achtergrond. Dit wijst op afbraak van eiwitten, onvolledige wassen van monsters of het gebruik van oude GST-RBD.

Figuur 1. Drie aparte cellijnen die verschillende niveaus van RhoC GTPase worden aangetoond dat lage niveaus van actieve en totale RhoC, een hoog niveau van actieve en totale RhoC of geen RhoC te tonen. De blot werd vervolgens gestript en reprobed met een antilichaam om het huis te houden-gen actine om te dienen als een laad-controle voor de totale RhoC eiwit.

Figuur 2. Meerdere bands of hoge achtergrond het gevolg is van afbraak van eiwitten, onvolledige wassen van de monsters of het gebruik van oude GST-RBD.

Discussie

De meest kritische fase van de procedure is de generatie van verse GST-RBD. Gebrek aan aandacht te besteden aan deze stap is de belangrijkste reden voor de mislukking. Alle stappen, van de generatie van de GST-RBD (1.2) op de overnacht incubatie met de cel lysaat (2.5), moet worden gedaan in een enkele dag. Een andere cruciale stap is om er zeker van dat er genoeg cellen om de cellysaten te produceren. Dit is vooral van belang als we kijken naar RhoC GTPase, die de neiging heeft om aanwezig te zijn in lage niveaus in de...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Glutathion-sepharose 4B beads	GE Healthcare	17-0756-01
Criterion 4-20% Tris-HCl gels	Bio-Rad	345-0032