Het bestuderen van de effecten van Matrix stijfheid op de cellulaire functie gebruik Acrylamide-based Hydrogelen

Summary

Het effect van substrata stijfheid op cellulaire functie kan worden gemodelleerd In vitro Gebruik van polyacrylamide hydrogelen van verschillende naleving.

Abstract

Weefsel stijfheid is een belangrijke determinant van cellulaire functie, en veranderingen in weefsel stijfheid worden vaak geassocieerd met fibrose, kanker en hart-en vaatziekten ^1-11. Traditionele cel biologische benaderingen aan het bestuderen van cellulaire functie door culturen van cellen op een vaste ondergrond (plastic borden of glas dekglaasjes) die niet kan goed zijn voor het effect van een elastische ECM of de variaties in ECM stijfheid tussen de weefsels. Om het model in vivo weefsel compliance in vitro, wij en anderen gebruiken ECM-gecoate hydrogels. In ons laboratorium worden de hydrogelen op basis van polyacrylamide die het bereik van het weefsel naleving biologisch ¹² gezien kan nabootsen. "Reactieve" dekglaasjes worden gegenereerd door incubatie met NaOH gevolgd door toevoeging van 3-APTMS. Glutaraldehyde wordt gebruikt om cross-link van de 3-APTMS en de polyacrylamide gel. Een oplossing van acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) en ammoniumpersulfaat wordt gebruikt voor de polymerisatie van de hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is opgenomen in de AC-oplossing voor het verknopen ECM eiwit aan de hydrogel. Na polymerisatie van de hydrogel, is de gel oppervlak bedekt met een ECM-eiwit van de keuze, zoals fibronectine, vitronectine, collageen, etc.

De stijfheid van een hydrogel kan worden bepaald door reologie of atomic force microscopie (AFM) en aangepast door het variëren van het percentage van de AC-en / of bis-AC in de oplossing ^12. Op deze manier kan substraat stijfheid worden afgestemd op de stijfheid van de biologische weefsels, die ook kan worden gekwantificeerd aan de hand reologie of AFM. Cellen kunnen vervolgens worden ingedeeld op deze hydrogelen en gekweekt op basis van de vereiste experimentele omstandigheden. Beeldvorming van de cellen en hun herstel voor moleculaire analyse is eenvoudig. Voor dit artikel, definiëren we zachte ondergrond als die met elastische moduli (E) <3000 Pascal en stijve ondergrond / weefsels als die met E> 20.000 Pascal.

Protocol

Voorbereiding

• Coverslips moet worden geautoclaveerd.
• Steriel gedestilleerd of gedeïoniseerd water moet worden gebruikt om oplossingen voor te bereiden en voor het wassen van dekglaasjes.
• AC (40% w / v) en bis-AC (1% w / v) oplossingen worden gesteriliseerd met 0,2 micrometer filtratie. Bereid 10% ammoniumpersulfaat (APS; 100μg/ml water) kort voor het gebruik en steriel filter. Vervang de APS-oplossing maandelijks.
• Chemische reagentia zoals 3-APTMS, chloroform, glutaradehyde, NHS, en SurfaSil dat niet kan worden geautoclaveerd worden bewaard in een toegewezen fles uitsluitend gebruikt voor de bereiding van hydrogelen.
• ....

Discussion

Een cruciaal element van de hydrogel polymerisatieproces is om te voorkomen dat luchtbel ontstaan ​​waardoor cellen te binden aan de glazen dekglaasje in plaats van de ECM-gecoate hydrogel zelf. Dit kan voorkomen worden door zorgvuldig te pipetteren de polymerisatie oplossing na vortexen en visueel ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen verstrikt zijn geraakt in de gel. We raden altijd aan de voorbereiding van extra "reactieve" coverslips en hydrogels om te zorgen genoeg voor experimenten.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glutaraldehyde, 70%	Sigma-Aldrich	G7776	Store at -20°C
3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%)	Sigma-Aldrich	281778	Store at room temperature
SurfaSil Siliconizing Fluid	Thermo Fisher Scientific, Inc.	42800	Store at room temperature
NHS (N-hydroxysucinimide Ester)	Sigma-Aldrich	A-8060	Store at 4°C Replace monthly
Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free	Sigma-Aldrich	A6003-100G	Store at 4°C
Coverslips (25mm)	Fisher Scientific	12-545-86 25 Cir 1D
Coverslips (18mm)	Fisher Scientific	12-545-84 18 Cir 1D