Het effect van substrata stijfheid op cellulaire functie kan worden gemodelleerd In vitro Gebruik van polyacrylamide hydrogelen van verschillende naleving.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het bestuderen van de effecten van Matrix stijfheid op de cellulaire functie gebruik Acrylamide-based Hydrogelen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Weefsel stijfheid is een belangrijke determinant van cellulaire functie, en veranderingen in weefsel stijfheid worden vaak geassocieerd met fibrose, kanker en hart-en vaatziekten 1-11. Traditionele cel biologische benaderingen aan het bestuderen van cellulaire functie door culturen van cellen op een vaste ondergrond (plastic borden of glas dekglaasjes) die niet kan goed zijn voor het effect van een elastische ECM of de variaties in ECM stijfheid tussen de weefsels. Om het model in vivo weefsel compliance in vitro, wij en anderen gebruiken ECM-gecoate hydrogels. In ons laboratorium worden de hydrogelen op basis van polyacrylamide die het bereik van het weefsel naleving biologisch 12 gezien kan nabootsen. "Reactieve" dekglaasjes worden gegenereerd door incubatie met NaOH gevolgd door toevoeging van 3-APTMS. Glutaraldehyde wordt gebruikt om cross-link van de 3-APTMS en de polyacrylamide gel. Een oplossing van acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) en ammoniumpersulfaat wordt gebruikt voor de polymerisatie van de hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is opgenomen in de AC-oplossing voor het verknopen ECM eiwit aan de hydrogel. Na polymerisatie van de hydrogel, is de gel oppervlak bedekt met een ECM-eiwit van de keuze, zoals fibronectine, vitronectine, collageen, etc.
De stijfheid van een hydrogel kan worden bepaald door reologie of atomic force microscopie (AFM) en aangepast door het variëren van het percentage van de AC-en / of bis-AC in de oplossing 12. Op deze manier kan substraat stijfheid worden afgestemd op de stijfheid van de biologische weefsels, die ook kan worden gekwantificeerd aan de hand reologie of AFM. Cellen kunnen vervolgens worden ingedeeld op deze hydrogelen en gekweekt op basis van de vereiste experimentele omstandigheden. Beeldvorming van de cellen en hun herstel voor moleculaire analyse is eenvoudig. Voor dit artikel, definiëren we zachte ondergrond als die met elastische moduli (E) <3000 Pascal en stijve ondergrond / weefsels als die met E> 20.000 Pascal.
Protocol
Voorbereiding
- Coverslips moet worden geautoclaveerd.
- Steriel gedestilleerd of gedeïoniseerd water moet worden gebruikt om oplossingen voor te bereiden en voor het wassen van dekglaasjes.
- AC (40% w / v) en bis-AC (1% w / v) oplossingen worden gesteriliseerd met 0,2 micrometer filtratie. Bereid 10% ammoniumpersulfaat (APS; 100μg/ml water) kort voor het gebruik en steriel filter. Vervang de APS-oplossing maandelijks.
- Chemische reagentia zoals 3-APTMS, chloroform, glutaradehyde, NHS, en SurfaSil dat niet kan worden geautoclaveerd worden bewaard in een toegewezen fles uitsluitend gebruikt voor de bereiding van hydrogelen.
- Voor de beste resultaten, moet hydrogels worden gebruikt binnen een paar dagen na de incubatie overnacht met de juiste ECM-eiwit.
- Bereid een 10% SurfaSil in chloroform (10 ml is meestal genoeg voor 20 top dekglaasjes) in een 50 ml polypropyleen Falcon buis voor het gieten van de hydrogel. (Ons laboratorium meestal siliconizes de top dekglaasjes tijdens de 0,5% glutaaraldehyde incubatie stap). Voeg de dekglaasjes om de Falcon buis en rock gedurende minstens 10 minuten. Giet het SurfaSil oplossing en lucht de dekglaasjes op Kimwipes droog in de biologische veiligheid kast waar de hydrogelen zal worden voorbereid.
- Bereid de hitte-geïnactiveerd BSA-oplossing als volgt: een 20 mg / ml, oplossing van de vetzuren vrij BSA in PBS is geïncubeerd in een 68 ° C waterbad gedurende 30 minuten. De oplossing wordt dan steriel gefiltreerd en opgeslagen bij 4 ° C.
Procedure
- Leg een laag van Parafilm op de onderste helft van een 150-mm petrischaal.
- Plaats tot 9 van 25 mm dekglaasjes op de top van de Parafilm en bedek ze met 1 ml 0,1 M NaOH. Incubeer gedurende 3 minuten en daarna zuigen met een stofzuiger lijn.
- Werken in een chemische kap, plaats 0,5 ml 3-APTMS op elke dekglaasje aan. Incubeer gedurende 3 minuten en daarna zuig het APTMS. Als je te lang wacht, zal een schuim vormen.
- Spoel na de dekglaasjes met 20 ml gedeïoniseerd water in dezelfde schotel. Verwijder de dekglaasjes van de schaal met behulp gebogen pincet en zet ze, met hun behandelde kant naar boven, naar een nieuw 150-mm schotel. Was de dekglaasjes met gedeïoniseerd water drie keer, op de rocker, gedurende 10 min. elke wasbeurt. Als u niet aan alle APTMS te verwijderen, zal het reageren met de glutaaraldehyde in de volgende stap en laat een wit troebel neerslag (Figuur 1).
- Ontdooi de glutaraldehyde (~ 10 min voor gebruik).
- Met behulp van gebogen tang, overdracht van de dekglaasjes om een schone schotel gelaagd met Parafilm en zuig de resterende vloeistof. Gebruik een stofzuiger lijn of Kimwipe om het resterende water blot als dat nodig is.
- Bedek alle dekglaasje met 0,5 ml van 0,5% glutaraldehyde in steriel gedeïoniseerd water en incubeer gedurende 30 minuten in een chemische kap. Zuig het glutaraldehyde. Spoel en was de dekglaasjes zoals in stap 4. Volledig droog de dekglaasjes. [Je kunt hier stoppen en laat de dekglaasjes enkele weken in een droge ruimte].
- Wanneer u klaar bent om de hydrogelen te bereiden, te gebruiken gebogen tang om de dekglaasjes, reactieve kant naar boven, over te dragen aan een blad van de Parafilm die is opgenomen op het oppervlak van de biologische veiligheid kabinet. Zorg ervoor dat de dekglaasjes plat op de Parafilm oppervlak.
- Bereid een verzadigde NHS oplossing in tolueen. (Los een kleine hoeveelheid van de NHS in voldoende tolueen voor de specifieke experiment. Hou het toevoegen van NHS beetje bij beetje tot de NHS niet meer oplost. De verzadigde oplossing is meestal bewolkt en roze.)
- Vervolgens de voorbereiding van de acrylamide, bis-acrylamide, water en APS om het gewenste percentage acrylamide te bereiken. Voeg de reagentia in microcentrifugebuizen zoals hieronder is beschreven tot een totaal volume van 0.8ml.
- Toen, op een aliquot in een tijd, de NHS toe te voegen en TEMED aan de 0,8 ml AC oplossing, vortex kort en ONMIDDELLIJK laat er eerst 3-5 gels met behulp van 140 ui per dekglaasje in de biologische veiligheid kap. Indien mogelijk moet alle stappen vanaf dit punt worden uitgevoerd in een biologisch veiligheidskabinet. [Let op: verschillende grootte dekglaasjes gebruikt kan worden op basis van behoefte. Als 18-mm dekglaasjes worden gebruikt, gebruik ~ 33 ul AC oplossing per dekglaasje en een 18-mm boven gesiliconiseerde dekglaasje aan.]
Bis-AC (%) 0.3 (stijf) 0.15 0.06 0,03 (zacht) ul ul ul ul Water 402 522 594 618 AC 150 150 150 150 Bis-AC 240 120 48 24 APS 8 8 8 8 TEMED 1 1 1 1 NHS 228 228 228 228 - Plaats snel de gesiliconiseerde 25-mm dekglaasje op de top van elke gel voordat het begint te polymeriseren. Toevoeging van de top dekglaasje moet het mogelijk maken van de AC om volledig te bedekken de bodem dekglaasje aan. Incubeer deze "sandwich" bij kamertemperatuur tot de AC polymeriseert. (Controleer de resterende AC oplossing in de microcentrifugebuis om te bepalen wanneer polymerisatie heeft plaatsgevonden. Meestal een paar minuten voor de stevige gel en een iets langer voor zachte degenen worden volstaan.).
- Voorzichtig pick-up van de sandwich (steriele handschoenen aan!) En schuif de bovenste dekglaasje tot het overhangen van de gepolymeriseerde gel. U kunt dan wrikken het uit de gel. Als u te lang wacht voordat u de top dekglaasje, zal de gel scheuren als het dekglaasje wordt verwijderd.
- Gooi de top dekglaasje aan. Plaats de onderste gel-dekglaasjes (hierna te noemen de hydrogel) in 6-well platen met 2 ml PBS / goed. PBS kunnen worden toegevoegd voor of na de gel-dekglaasje aan elk putje. Was de hydrogels met PBS drie keer, op een rocker, 5 min per wasbeurt.
- Herhaal stap 11-14 totdat het vereiste aantal van hydrogelen is opgesteld.
- Bedek elk hydrogel met 2 ml van een fibronectine-oplossing (3 ug / ml in PBS) of andere ECM-eiwit (zie Klein et al.. 13 voor meer informatie.). De ECM-eiwit wordt covalent gebonden aan de hydrogel tijdens de nacht incubatie bij 4 ° C.
- Zuig het ECM-oplossing en blok niet-gereageerde NHS met 1mg/ml hitte-geïnactiveerd vetzuren vrij BSA in serum-vrije media voor minstens 30 min bij 37 ° C in een celkweek incubator. Zodra Spoel de hydrogels met steriel PBS of celkweek medium.
- Plaat cellen in de juiste kweekmedium dat FBS. Het aantal cellen gezaaid op de hydrogel moet worden bepaald door de gebruiker op basis van de mate van cel verspreiding en confluentie die nodig zijn voor experimenten. Ongeveer 10 5 cellen is meestal voldoende voor westerse blotting en qPCR analyse.
- Na de incubatie periode kan cel eiwit of mRNA worden gehaald. De dekglaasjes worden zorgvuldig verwijderd uit de bronnen met behulp van gebogen pincet en geplaatst (cell-side down) op de top van 100 ul druppeltjes lysis buffer die zijn gespreid (2-3cm) langs een vel Parafilm op het lab bank. (Wij gebruiken standaard SDS sample buffer en TRIzol, respectievelijk van monsters voor te bereiden op western blotting en om RNA te isoleren voor qPCR.) Incubeer de cellen met de lysis buffer gedurende precies een minuut. Verwijder de dekglaasjes en breng de lysis buffer om een microcentrifugebuis. Als alternatief voor de RNA-extractie alleen, kan de gebruiker elke hydrogel over te dragen aan een nieuwe 6-well plaat en voeg 1 ml TRIzol / goed. Incubeer gedurende 3 minuten en verwijder TRIzol oplossing voor opslag in een microcentrifugebuis.
Aanvullende informatie over de procedures, zoals immunofluorescentie, is BrdU kleuring, transfectie, enz. voor cellen gezaaid op hydrogels beschreven in Klein et al.. 2007 13.
Representatieve resultaten
Grondig wassen van de dekglaasjes na toevoeging van APTMS is een belangrijke stap in het produceren van "reactieve" dekglaasjes. Indien een niet volledig te verwijderen van de APTMS, zal het reageren met de glutaaraldehyde in de volgende stap en een wit troebel neerslag zoals te zien in figuur 1A. Figuur 1B toont een goed gewassen en gedroogd dekglaasje aan. Als de neerslag zich ontwikkelt, moet de hele procedure opnieuw worden gestart vanaf het begin als het dekglaasje niet meer bruikbaar is.
Na de vorming en hydrogel coating met ECM-eiwitten 's nachts, kunnen cellen worden gezaaid de volgende dag. Zoals figuur 2 laat zien, is er een duidelijk verschil tussen de cel verspreiding op harde versus zachte hydrogels. Zoals kan worden gezien door phalloidin kleuring in muis embryonale fibroblasten (MEF), cellen zich tot een grotere mate op stijf in vergelijking met zachte hydrogels. Sterker nog, zullen de meeste cellen verbonden aan een zachte hydrogel blijven compact en hechten minder efficiënt.
Hoewel slechts MEF morfologie is weergegeven in figuur 2, het verschil in cel verspreiden is consistent in de verschillende andere cellijnen getest 11-12,14.
Geheimen tot succes
- Zodra de procedure is gestart, is het zeer belangrijk om de dekglaasjes te houden met de 'reactieve' naar boven en in het achterhoofd te houden aan welke zijde is gecoat.
- Handschoenen moeten worden gedragen ten allen tijde tijdens de procedure om een werkomgeving die zo steriel mogelijk te verstrekken.
- Het grootste deel van de eerste stappen worden uitgevoerd tussen een chemische dampkap en het lab bank. Alle stappen na het verwijderen van overtollige glutaaraldehyde uit de dekglaasjes moet worden uitgevoerd onder een biologische veiligheid kast.
- Vanwege de verschillen in cel spreaDing (figuur 2), raden we zaaien tweemaal het aantal cellen op een zachte hydrogels in vergelijking met stijve hydrogels.
- De AC polymerisatie proces is zeer snel. Voor de eerste keer gebruikt, kan een daling van de hoeveelheid APS of TEMED in de oplossing van het polymerisatieproces te verlengen. Probeer niet meer dan een paar dekglaasjes voor te bereiden in een keer.
- In de celcyclus studies waar synchronisatie in G0 nodig is, we meestal serum-verhongeren cellen in plastic cultuur gerechten, trypsinize de cellen en reseed ze op hydrogelen van verschillende naleving in de aanwezigheid van mitogenen (FBS en / of groeifactoren). Deze procedure zorgt ervoor dat de start bevolking van G0-gesynchroniseerde cellen is identiek in alle monsters. Echter, voor veel signaaltransductie studies, kan de vereiste mitogeen stimulatie periode niet lang genoeg zijn om voor de bevestiging en de verspreiding van de cellen. In dit geval hebben we serum-verhongeren de cellen op de hydrogels en vervolgens direct te stimuleren met mitogeen.
Figuur 1A. Verkeerd gewassen dekglaasje aan. Na toevoeging van APTMS, was dekglaasje gewassen voor 1-2 minuten voor de toevoeging van de glutaaraldehyde-oplossing. Een neerslag vormen op het dekglaasje dat niet is gewassen volgens de stappen beschreven in procedure.
Figuur 1B. Goed gewassen dekglaasje aan. Na toevoeging van APTMS, was dekglaasje gewassen voor drie keer 10 minuten elk voor toevoeging van de glutaaraldehyde-oplossing. Geen neerslag vormt op het dekglaasje.
Figuur 2. Morfologie van de cellen op hydrogelen met verschillende stijfheid. Gevestigde MEFs werden gezaaid op met fibronectine gecoate hydrogelen van hoge of lage stijfheid voor 9 uur. Na de incubatieperiode werden de cellen gefixeerd, gepermeabiliseerd en gekleurd met FITC-phalloidin, die bindt aan F-actine. MEF op hoge stijfheid gels vertonen stress-vezels en zijn goed verspreid in vergelijking met die gezaaid op lage stijfheid hydrogels. Schaalbalk = 50μm.
Figuur 3. Vertegenwoordiger van kwantitatieve PCR resultaat van de muis cycline D1 mRNA niveaus. Serum uitgehongerd muis embryonale fibroblasten werden uitgeplaat op een hoge (3% acrylamide) of laag (0,3% acrylamide) stijfheid hydrogels en gestimuleerd met 10% FBS voor 9 uur. Na de RNA-extractie, was real-time kwantitatieve PCR-analyse uitgevoerd voor cycline D1 mRNA niveaus (genormaliseerd voor 18S RNA). G0 vertegenwoordigt cycline D1 mRNA van slapende cellen. Cycline D1 mRNA waarden significant stijgen op stijf hydrogelen, maar niet op zachte hydrogels. De gegevens zijn gemiddelde + / - SD van dubbele PCR-reacties.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een cruciaal element van de hydrogel polymerisatieproces is om te voorkomen dat luchtbel ontstaan waardoor cellen te binden aan de glazen dekglaasje in plaats van de ECM-gecoate hydrogel zelf. Dit kan voorkomen worden door zorgvuldig te pipetteren de polymerisatie oplossing na vortexen en visueel ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen verstrikt zijn geraakt in de gel. We raden altijd aan de voorbereiding van extra "reactieve" coverslips en hydrogels om te zorgen genoeg voor experimenten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Werk is ons laboratorium wordt ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Glutaraldehyde, 70% | Sigma-Aldrich | G7776 | Bewaren bij -20°C |
| 3-APTMS (3-aminopropyltrimethoxysilaan 97%) | Sigma-Aldrich | 281778 | Bewaren bij kamertemperatuur |
| SurfaSil siliconeringsvloeistof | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 42800 | Bewaren bij kamertemperatuur |
| NHS (N-hydroxysuccinimide-ester) | Sigma-Aldrich | A-8060 | Bewaren bij 4°C; maandelijks vervangen |
| Albumine, runderserum, in essentie vetzuurvrij | Sigma-Aldrich | A6003-100G | Bewaren bij 4°C |
| Dekglasjes (25mm) | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | |
| Dekglasjes (18mm) | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
Referenties
- Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta. J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).
- Bernini, G. Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibrosis in patients with primary aldosteronism. J Hypertens. 26, 2399-2405 (2008).
- Boonyasirinant, T. Aortic stiffness is increased in hypertrophic cardiomyopathy with myocardial fibrosis: novel insights in vascular function from magnetic resonance imaging. J Am Coll Cardiol. 54, 255-2562 (2009).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Duprez, D. A., Cohn, J. N. Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).
- Lee, R. T. Prediction of mechanical properties of human atherosclerotic tissue by high-frequency intravascular ultrasound imaging. An in vitro study. Arterioscler Thromb. 12, 1-5 (1992).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples. Phys Med Biol. 52, 1565-1576 (2007).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad Sci USA. 94, 13661-13665 (1997).
- Klein, E. A., Yung, Y., Castagnino, P., Kothapalli, D., Assoian, R. K. Cell adhesion, cellular tension, and cell cycle control. Methods Enzymol. 426, 155-175 (2007).
- Klein, E. A. Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening. Current Biology. 19, 1511-1518 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
