De organoptypic hippocampus slice cultuur-model is een In vitro Model gebruikt om de neuronale verwonding in een verscheidenheid van paradigma te onderzoeken. In dit artikel beschrijven we de methoden voor het genereren van slice culturen en kwantificeren van neuronale verwonding.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
De organotypische hippocampus Slice Cultuur Model is voor de behandeling Neuronale Letsel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Organotypische hippocampale slice cultuur is een in vitro methode om de mechanismen van de neuronale schade in de basisarchitectuur en samenstelling van de hippocampus relatief behouden blijft een te onderzoeken. Het organotypische cultuur systeem maakt het mogelijk voor het onderzoek van neuronale, astrocytaire en microgliale effecten, maar als een ex vivo voorbereiding, wordt niet ingegaan op effecten van de bloedstroom, of aanwerving van perifere inflammatoire cellen. Te dien einde, is deze cultuur methode vaak gebruikt om excitotoxisch en hypoxische schade aan piramidale neuronen van de hippocampus te onderzoeken, maar is ook gebruikt om de ontstekingsreactie te onderzoeken. Hierin beschrijven we de methoden voor het genereren van de hippocampus slice culturen van postnatale knaagdieren hersenen, het toedienen van giftige stimuli om neuronale letsel veroorzaken, en het testen en kwantificeren van hippocampale neuronale dood.
Protocol
1. Voorbereiding
Voordat u begint, verzamelen de benodigde chirurgische instrumenten, dissectie en cultuur media, en 7 dagen oude rat of muis pups. Het protocol is hetzelfde voor muis en rat preparaten.
(I) materialen en apparatuur
- Operating schaar (rechte lengte 6 ", cat # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD)
- Micro ontleden schaar, (lengte 4 '", cat # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD)
- Koolstofstaal Dumont pincet (cat # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD)
- Gewijzigd glas "overdracht" pipetten (onderkant van Pasteur pipet verwijderd en de rand glad)
- Aclar plastic folie gesneden om 2 "in x 2" in vierkanten (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA)
- Cover sponzen 4 door 3 in (Kendall, cat # 3157, Mansfield, MA)
- 30 mm Millicell membraan inserts (0,4 micrometer, Millipore, Bedford, MA)
- Mcllwain Tissue chopper met tweesnijdende scheermesje (McILwain weefsel chopper, Vibratome Company, St. Louis, MO)
- Omgekeerde microscoop met CCD-camera en beeldanalyse-software
(Ii) Dissection Medium (DM, 1 liter bij een pH van 7,3)
| Balanced Salt Hank's | 1 injectieflacon (95,2 g/1L) (Sigma: H2387) |
| NHCO 3 (4,2 mm) | 350 mg |
| HEPES (10 mm) | 2,83 g |
| Glucose (33,3 mm) | 6,0 g |
| Penicilline / streptomycine (100x) | 10 ml |
| BSA (0,3%) | 300 mg |
| MgSO 4-7H 2 O | 1,44 g |
(Iii) Cultuur medium (400 ml)
| MEM (Invitrogen 11575-032) | 200 ml |
| *** Hank's Balance Salt (Invitrogen 24020-117) | 100 ml |
| Paard serum (Invitrogen 26050-070) | 100 ml |
| HEPES buffer (een M; Invitrogen 15630-080) | 5 ml |
| Penicilline / streptomycine (100x) | 4 mL |
| *** Voeg 12,8 g glucose naar Balance 500 ml Hank's Salt alvorens kweekmedium | |
(Iv) Dieren
7 dagen oude rat of muis postnatale pups, meestal een nest per experiment.
2. Op de Dag van de Cultuur
- Alle dissectie werktuigen en Aclar film moet worden geweekt in 70% EtOH gedurende 30 minuten voordat u begint. Het oppervlak van de dissectie motorkap, blad, en weefsel chopper moeten worden gedesinfecteerd met ethanol.
- Bereid een aantal (3-4) 6 well kultuur platen, voeg 1 ml kweekmedium per goed, en plaats een Millipore permeabel membraan in elk putje. Plaats 6-well platen in de 37 ° incubator pas klaar om plakjes te dragen.
- Bereid een aantal (4-6) 60 mm platen met DM en leg ze op ijs.
- Snel onthoofden met een schaar en duik in 70% EtOH, en snel de hersenen bloot te leggen met een saggital insnijding van de schedel. Voorzichtig onmiddellijk verwijderen van de hersenen en de plaats in koude DM. Scheiden in twee helften en leg elk halfrond mediale zijde naar beneden op een deksel spons voor 2-3 seconden.
- Til en het halfrond plaats op de Aclar film plein en op het weefsel helikopter; coronaalwaarts snijd de hersenen in 350 micrometer secties. Wanneer u klaar bent, voorzichtig neem de Alcar plein met de doorsnede halfrond en onderdompelen in koud DM.
- Met behulp van een dissectiemicroscoop, scheiden van de hippocampus secties. Voor de rat, moet er vijf secties verspreid over rostraal naar caudaal hippocampus, en voor de muis moeten er drie tot vier secties.
- Haal de 6-well platen met membraan inserts uit de 37 ° weefselkweek incubator. Individueel overdracht hippocampale plakken op de doorlaatbare membranen met behulp van de glazen pipet overdracht. Als er te veel DM is losgelaten op het membraan, verwijder overtollige DM met een Pasteur pipet. Plaats vijf hippocampale plakken op elk membraan. Laat minstens 3 putten per aandoening, of 15 plakjes.
- Incubeer de cultuur platen bij 37 ° in een 5% CO bevochtigde incubator voor 12-14 dagen voor het begin van de toxiciteit experiment. De cultuur medium kan twee keer per week worden gewijzigd.
3. Inducerende en kwantificeren van de hippocampus neuronen letsel bij Slice Cultuur
- Na 12-14 dagen in cultuur, voeg 5 ug / ml propidiumjodide (PI) aan de cultuur media. Deze stap zal visualisatie en kwantificatie van basale celdood.
- De volgende dag, kwantificeren PIfluorescentie in het CA1 subregio (en / of CA3 of dentate indien gewenst) van elke plak hippocampus en het verkrijgen van: de PI-fluorescentie metingen die basale celdood (aangeduid als de tijd = 0 uur, of T 0). Voor het imago van acquisitie en kwantificering, gebruiken we Openlab software (Improvisation, VK), maar ook andere beeldacquisitie en analyse software kan worden gebruikt om de fluorescentie-intensiteit te kwantificeren.
- Direct na het imago overname van T 0 PI fluorescentie, braken neuronale verwonding door je manier van keuze (we hebben gebruikt 10 uM NMDA, zuurstof-glucose ontbering, of LPS gedurende een uur tot 2,5 neuronale toxiciteit veroorzaken). Na de giftige stimulus, vervang medium met vers medium met 5 ug / ml PI en 's nachts te onderhouden plakjes.
- Op dag 3, kwantificeren betekenen PI fluorescentie van de experimentele conditie bij 24 of T 24.
- Na dit beeld overname, onmiddellijk verandering medium en voeg 10 uM NMDA en 5 ug / ml PI en incubeer plakken 's nachts om maximale neuronale dood te bereiken.
- Op dag 4, kwantificeren betekenen PI fluorescentie van maximaal neuronale dood, gedefinieerd als T-max. Bereken procent celdood als volgt: (T 24 - T 0) / (T max-T 0).
4. Representatieve resultaten
Figuur 1. (A) Tijd lijn voor het genereren van de hippocampus en de daaropvolgende experimentele letsel en beeldacquisitie. (B) Representatieve beelden van de hippocampus plakken basaal (T 0), 24 uur na een 1 uur blootstelling aan 10 uM NMDA (T 24), en na nog eens 24 of 10 uM NMDA tot maximale neuronale verwonding (T max) te verkrijgen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn twee belangrijke punten om te volgen om reproduceerbare en consistente resultaten te waarborgen bij het repliceren van experimenten. Ten eerste is het belangrijk om de hippocampus plakken leeftijd verhuurd voor 12-14 dagen voor de experimenten. Met slice isolement, is er een significant microgliale reactie, en microglia geactiveerd blijven voor enige tijd, met een terugkeer naar een rustplaats vertakte staat die zich per dag 10 in vitro 3,6. Ten tweede, de gemiddelde PI fluorescentie-intensit...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Gefinancierd door NINDS, American Heart Association, American Federation for Aging Research, March of Dimes
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Referenties
- Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).
- McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia. J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).
- Czapiga, M., Colton, C. A. Function of microglia in organotypic slice cultures. J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).
- Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures. J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).
- Wu, L., Wang, Q., Liang, X. Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival. Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18, 319-319 (1996).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
