Orale toediening van Rotenon met behulp van een Gavage en beeldanalyse van de Alpha-synucleïne inclusies in het enterisch zenuwstelsel

Samenvatting

De ziekte van Parkinson is gerelateerd aan de blootstelling aan pesticiden. Hier laten we een methode om pesticiden met behulp van een maagsonde in de gewenste concentratie en een methode om het effect te analyseren in de alfa-synucleïne accumulatie in het enterisch zenuwstelsel te leveren.

Samenvatting

Bij de ziekte van Parkinson (PD) patiënten, de bijbehorende pathologie volgt een karakteristiek patroon met betrekking tot onder meer het enterisch zenuwstelsel (ENS) ^1,2, de bulbus olfactorius (OB), de dorsale motor nucleus van de vagus (DMV) ^3, de intermediolateral kern van het ruggenmerg ⁴ en de substantia nigra, die de basis vormen voor de neuropathologische enscenering van de ziekte ^4,5. De ENS en de OB zijn de meest blootgestelde nerveuze structuren en de eersten die worden getroffen. Interessant is PD in verband gebracht met blootstelling aan pesticiden ^6-8. Hier laten we in detail twee methoden die worden gebruikt in onze vorige studie ^9. Om de effecten van rotenone handelen lokaal op de ENS analyseren, we worden toegediend met behulp van een maagsonde rotenon tot een jaar oud C57/BL6 muizen. Rotenon is een veel gebruikte bestrijdingsmiddel die sterk remt mitochondriaal complex I ^10. Het is zeer lipofiele en slecht geabsorbeerd in het maag-darmkanaal ^11. Onze resultaten toonden aan dat de toediening van 5 mg / kg van rotenon niet mitochondriaal complex I-activiteiten in de spier of de hersenen te remmen. Dus, wat suggereert dat het gebruik van onze administratie methode rotenon niet de hepatoportale systeem kruis en handelde uitsluitend op de ENS. Hier laten we een methode om pesticiden met behulp van een maagsonde en de beeldanalyse protocol dat wordt gebruikt om de effecten van het pesticide te analyseren in alfa-synucleïne accumulatie in het ENS te beheren. Het eerste gedeelte is een methode die intragastrische toediening van pesticiden (rotenon) maakt het mogelijk op een gewenste exacte concentratie. De tweede methode laat een semi-automatische beeldanalyse-protocol om alfa-synucleïne accumulatie te analyseren in de ENS met behulp van een beeldanalyse-software.

Protocol

1) intragastrische Toediening van Rotenon

1. Weeg het dier.
2. Bereken het totale volume van de benodigde rotenone / voertuig oplossing. In dit geval is 0,01 ml per gram van het dier gewicht.
3. Laad een 1 ml spuit met de eerder berekende volume van rotenon-oplossing (0,625 mg / ml rotenon, 4% carboxymethylcellulose en 1,25% chloroform) of voertuig-oplossing (4% carboxymethylcellulose en 1,25% chloroform). In dit geval komt overeen met een 5 mg / kg rotenon dosis.
4. Pak de muis, en met de muis zijn staart met een hand de huid van de hals door te trekken met de eerste twee vingers van de andere hand.
5. Zodra het hoofd is bevestigd tussen de twee vingers, leunen tegen de palm van de hand en draai hem ondersteboven. Bevestig de staart met behulp van de vierde en vijfde vingers.
6. Houd het hoofd naar achteren, drukt u op het gehemelte van de muis mond open. Voorzichtig introduceren de maagsonde in de mond. Het is belangrijk dat het gebruik van een maagsonde naald en geen gewone naald. Langzaam beweegt de maagsonde in de richting van de maag ver genoeg. Hierdoor wordt voorkomen dat materiaal krijgt in de longen.
7. Dien de rotenone oplossing of het voertuig door zachtjes te drukken op de embolus. Wanneer voltooid, langzaam extract van de maagsonde.
8. Plaats het dier terug in een andere kooi totdat alle dieren van de ene kooi worden gedaan.

2) Immunokleuring Procedures

1. Na de behandeling, muizen zijn verdoofd met behulp van Ketamin 100 mg / kg und Xylazin 10 mg / kg ip en intracardiaal geperfuseerd met 4% paraformaldehyde in PBS.
2. Het lef worden vervolgens geëxtraheerd door dissectie, en geplaatst in 15% sucrose 's nachts. De volgende dag, is het weefsel overgebracht naar 30% sucrose en geïncubeerd weer overnacht bij 4 ° C.
3. Het weefsel wordt dan geplaatst in Tissue-tek en opgeslagen in een -80 ° C vriezer tot gebruik.
4. Met behulp van een cryostaat, zijn 20 micron darm doorsneden overgebracht naar Superfrost dia's.
5. Blokkeren en immunokleuring procedures gebruik van anti-βIII-tubuline en anti-alfa-synucleïne antilichamen worden dan uitgevoerd zoals eerder beschreven ^9.

3) Alfa-synucleïne Inclusion Image Analysis

Het wordt aanbevolen om een ​​externe persoon zich niet bewust van beelden 'oorsprong de analyse uitvoert. Daarom moeten de gegevens worden overgegaan. Beeldanalyse werd uitgevoerd met behulp van FIJI software.

1. Open het confocale image-bestand. Vervolgens splitsen de kanalen, zodat het mogelijk is om zelfstandig te werken op elk kanaal.
2. Sluit die kanalen die niet zullen worden gebruikt en Analyse> Stel Schaal en de Pixel grootte 1 set te selecteren. Stel de bekende afstand tot 0,13 (dit zal afhangen van de doelstelling en de gebruikte resolutie) en klik op de wereldmarkt. De grootte van de afbeelding wordt nu weergegeven in microns.
3. Selecteer de alfa-synucleïne kanaal en kies ganglion, zorg ervoor dat de selectie van het ganglion omvat in alle segmenten.
4. Druk op Afbeelding> Dupliceren om de afbeelding te dupliceren. Met het ganglion geselecteerd, wordt alleen een beeld van de grootte van het ganglion zal worden gedupliceerd.
5. Druk op Bewerken> Wissen Outside. Het gedeelte van het beeld buiten de geselecteerde regio zal zwart worden.
6. Dupliceer de afbeelding opnieuw te bepalen in latere stappen hoe goed de procedure ging. Beelden die een hoge signaal-ruis-verhouding op de achtergrond hebben, moeten niet worden gebruikt voor beeldanalyse.
7. Selecteer Image> Adjust> Drempel en selecteer vervolgens MaxEntropy. Dan bewegen over de plakjes in de bijgesneden afbeelding en het origineel om ervoor te zorgen dat de procedure goed is gegaan. De entropische drempel kiest een intensiteit signaal niveau op basis van het beeld histogram en alleen die pixels met intensiteiten hoger dan deze drempel zal worden weergegeven in een wit dan zwart beeld.
8. Selecteer Proces, klik dan op Smooth. Deze stap transformeert de pixeled randen van de beelden in gladde randen.
9. Selecteer Process, klik dan op Binary en kies Maak Binary. Het beeld wordt weergegeven als een zwart over wit beeld.
10. Kopie van de foto naar de volgende stap op de gedupliceerde afbeelding uit te voeren.
11. Klik op Analyseren> Analyze deeltjes. Vervolgens selecteert u Tonen: Outlines en klik op Samenvatten. De rest van de instellingen moet worden bladeren in verzuim. Deze functie herkent het totaal aantal pixels met een signaal en die bij elkaar zijn gegroepeerd. De totale oppervlakte van de pixels met het signaal plus het aantal groepen van pixels en de gemiddelde grootte zijn gemeld.
12. Vergelijk en kies de grootste plak die goed past. De slice wordt gemarkeerd.
13. Kopieer de gegevens tabel met de totale alfa-synucleïne oppervlakte, het aantal insluitsels en de gemiddelde deeltjesgrootte. Plak de gegevens in een Excel-spreadsheet of een geannoteerde elders.
14. Keer terug naar Fiji en vind de eerder geselecteerde segment in het β-tubuline kanaal, en selecteer het.
15. Selecteer ganglion gebied en klikt u op Analyseren en selecteer maatregel. Een andere tafel zal verschijnen met detotale oppervlakte van het ganglion.
16. Extract van de gegevens uit de tabel om de Excel sheet de buurt van de alfa-synucleïne meting of kopiëren naar beneden elders.
17. Met behulp van Excel, verdelen de verschillende parameters verkregen in de alfa-synucleïne meting door het ganglion oppervlak van de totale alfa-synucleïne oppervlak en integratie nummer genormaliseerd door ganglion grootte te verkrijgen.

4) representatieve resultaten

Bij de maagsonde administratie-protocol correct wordt uitgevoerd en de ongemakken voor het dier zijn minimaal. Behandeling met deze concentratie van rotenon in staat stelt een lokaal effect van rotenon op de ENS, zonder rotenone niveaus in het bloed en geen remming van de spieren of de hersenen mitochondriaal complex heb ik zelfs na 1,5 maanden van de behandeling (zie figuur 1). Als beeldanalyse correct wordt uitgevoerd een grondige analyse van alfa-synucleïne patroon moet mogelijk zijn. Het geeft betrouwbare gegevens over de totale hoeveelheid van alfa-synucleïne (totale oppervlakte), alfa-synucleïne patroon in de cel (aantal insluitingen) en de aanwezigheid van alfa-synucleïne insluitsels (inclusie grootte) (figuur 2).

Figuur 1. Motorische disfunctie in rotenon behandelde muizen zonder detectie van rotenon in bloed of CNS. A, standaard (50 ng / ml) en chromatogram van de hersenen monsters van 20, 10 en 5 mg / kg behandelde muizen. B en C, kwantificering van rotenon niveaus in het bloed (B) en CNS (C). B, het bloed een , 2 en 3 uur na de behandeling. De muizen werden verdeeld in drie groepen (n = 3) en behandeld met 2,5, 5, 10 en 20 mg / kg rotenon (n = 3), werd 300 ul bloed onttrokken 1, 2 en 3 uur na de toediening rotenon en samen samengevoegd voor HPLC-analyse. C, werden de muizen behandeld gedurende een week een keer per dag met 5 (n = 3), 10 (n = 3) en 20 (n = 1) mg / kg rotenon, de hersenen en de hersenstam werden geëxtraheerd 1 en 2 uur na laatste toediening en voorbereid voor HPLC-analyse. D, mitochondriaal complex I-activiteiten in de spieren en de hersenen monsters van 1,5 maand behandelde muizen.

Figuur 2. Lokaal beheerde rotenon induceert alfa-synucleïne fosforylatie, accumulatie en aggregatie met gliosis in ENS ganglia. (Schaal staven 20 micrometer). A, B, C, anti βIII-tubuline, alfa-synucleïne en DAPI kleuring in twaalfvingerige darm (B) en het ileum ( A, C) secties. Pijl in B, 1,5 maanden behandeling veroorzaakte een verhoogde alfa-synucleïne punctata patroon in enterische zenuwstelsel ganglia ten opzichte van drie maanden controles (A). Pijl in C, 3 maanden behandeling geïnduceerde vorming van grotere alfa-synucleïne insluitsels (ø> 6 micrometer). D, immunofluorescentiekleuring gebruik van anti-alfa-synucleïne, Thioflavine S en DAPI. Pijl in D, slechts drie maanden behandelde muizen toonden aggregatie van deze grotere alpha-synucleïne ophopingen. E, E ', E'', beeldanalyse kwantificering stappen. E, voorbeeld van de afbeelding gebruikt in de kwantificering met een ENS ganglion immunostained tegen alfa synucleïne zien verschillende insluitsels. E ', bijvoorbeeld van het beeld verkregen na beeldanalyse-protocol.''E, overlap tussen een aantal van de oorspronkelijke inclusies (groen) en de vertegenwoordiging verkregen na het uitvoeren van het protocol (gele lijnen). FG, kwantificering van het experiment getoond in AC is gemaakt met behulp van automatische segmentatie en entropie op basis van drempelwaarden methoden. Single-sterretje, P <0,05, en dubbel-sterretje, P <0,01. F, elke kolom is het totaal van alfa-synucleïne oppervlakte / ganglion oppervlak. G, elke kolom staat het totale aantal van alfa-synucleïne insluitsels / ganglion oppervlak. Alle grafieken tonen de gemiddelde ± sem

Discussie

Maag administratie is al eerder uitgevoerd ^12. Echter, volgens manuscript Inden's, rotenon werd toegediend opgelost in 0,5% carboxymethylcellulose natriumzout (CMSS) alleen. Rotenon is een hoog liphophylic stof. Daarom kan rotenon niet worden opgelost in 0,5% CMSS alleen en zal neerslaan zo gedaan. Het gebruik van chloroform ontstaat een gelijkmatig verdeeld rotenon opschorting te vermijden neerslag. Bovendien, als gevolg van de hogere concentraties van het bestrijdingsmiddel in de CMSS, wordt de definiti...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Duitsland
Chloroform	Carl Roth GmbH	3313.1	Duitsland
Carboxymethylcellulose	Sigma-Aldrich	C5678	Duitsland
Gavage 1,2 mm x 60 mm	Unimed		Zwitserland
LSM 510	Carl Zeiss, Inc.
FIJI	http://pacific.mpi-cbg.de