Isolatie van Valvulaire endotheelcellen

Samenvatting

Wij bieden een methode voor het isoleren en kweken van zuivere populaties van hartklep endotheelcellen (VEC). VEC kan worden geïsoleerd uit beide zijden van de cusp of bijsluiter en onmiddellijk na de onderliggende interstitiële cel (VIC) isolatie is eenvoudig.

Samenvatting

Hartkleppen zijn zelf verantwoordelijk voor het handhaven van een richting bloedstroom door het cardiovasculaire systeem. Deze dunne, vezelige weefsels worden blootgesteld aan grote mechanische belastingen als ze te openen en meerdere miljard keer dicht boven een levensduur. De ongelooflijke uithoudingsvermogen van deze weefsels is te wijten aan de bewoner valvulaire endotheel (VEC) en interstitiële cellen (VIC) die constant reparatie en renovatie in reactie op de lokale mechanische en biologische signalen. Pas sinds kort zijn we begonnen met het unieke gedrag van deze cellen, die in vitro experimenten heeft een belangrijke rol gespeeld te begrijpen. Een bijzondere uitdaging is de isolatie en de cultuur van VEC. Speciale zorg moet worden toegepast vanaf het moment dat het weefsel is verwijderd uit de host via finale plating. Hier presenteren wij protocollen voor directe isolatie, side specifieke isolement, cultuur, en verificatie van pure populaties van VEC. We maken gebruik van enzymatische vertering, gevolgd door een zachte doekje scraping techniek om alleen aan de oppervlakte cellen los te maken. Deze cellen worden vervolgens verzameld in een buis en gecentrifugeerd tot een pellet. De pellet wordt vervolgens geresuspendeerd en uitgeplaat in kweekflesjes pre-gecoat met collageen I matrix. VEC fenotype wordt bevestigd door contact remde de groei en de expressie van endotheliale specifieke markers, zoals PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), en negatieve expressie van alfa-gladde spiercel actine (α-SMA). De functionele eigenschappen van VEC geassocieerd zijn met hoge niveaus van LDL geacetyleerde. In tegenstelling tot de vasculaire endotheliale cellen, VEC hebben de unieke capaciteit om te zetten in mesenchym, die normaal optreedt tijdens de embryonale klep vorming van ^een. Dit kan ook optreden tijdens significant verlengd bericht samenvloeiende in vitro cultuur, dus zorg moeten worden geleverd om doorgang op of nabij samenvloeiing. Na het VEC isolatie, kan pure populaties van de VIC dan gemakkelijk worden verkregen.

Protocol

1. Voorbereiding

1. Autoclaaf in een overdekte instrument lade de volgende items:
   1. Gekartelde weefsel pincet - Voor de behandeling van de folder weefsel
   2. Tissue schaar (8 cm) - voor het snoeien van folder weefsel en knobbels
   3. Wattenstaafjes - Voor het isoleren van de endotheliale laag van de folder of cusp
2. Maak steriele collagenase oplossing
   1. Voeg 4,0 gram gemalen DMEM tot 250 ml van 18 MΩ water.
   2. Voeg 1,11 gram natriumbicarbonaat.
   3. Voeg (600 U / ml) 180.000 eenheden van collagenase.
   4. Voeg 1% (3 ml) penicilline / streptomycine.
   5. Breng de pH van de oplossing tot 7,2.

Discussie

Een begrip van valvulaire biologie is aangetast door de technische problemen te isoleren en kweken van zuivere populaties van valvulaire endotheelcellen. Typische isolatietechnieken betrekken enzymatische vertering van de onderliggende basale matrix of chemische dissociatie van endotheliale lijmverbindingen ^2,3. Voorlopige isolatie experimenten werden kwalitatief onderzocht door het variëren van dissociatie agenten en incubatietijd. De resultaten van deze experimenten toonden aan dat EDTA (of trypsine-EDTA) i.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Mediatech, Inc.	50-103-PB
Foetaal runderserum	GIBCO, by Life Technologies	26140
Penicilline Streptomycine	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
0.25% Trypsine-EDTA	GIBCO, by Life Technologies	25200
Heparine natriumzout	Sigma-Aldrich	H4784-1G
Collagenase Type 2	Worthington Biochemical	LS004176
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	21300-058
Rattenstaartcollageen	BD Biosciences	354236
Critical Swabs	VWR international	89031-270
Natriumbicarbonaat	Sigma-Aldrich	55761
T25 kolfen	BD Biosciences	353018
T75 kolfen	BD Biosciences	353136
24-wells plaat	Falcon BD	353047
60x15 mm schaaltjes	VWR international	25384-092
60x15 glazen schaaltjes	VWR international	89000-310
Paraffine inbeddingswas	Electron Microscopy Sciences	19304-01
Precision Glide naalden	BD Biosciences	305165
500 mL Nalgene filters	VWR international	73520-985
1L Nalgene filters	VWR international	73520-986
Weefselpincet	Fine Science Tools	11023-15
FSC pincet #5	Fine Science Tools	11295-00