Isolatie van Valvulaire endotheelcellen

Samenvatting

Wij bieden een methode voor het isoleren en kweken van zuivere populaties van hartklep endotheelcellen (VEC). VEC kan worden geïsoleerd uit beide zijden van de cusp of bijsluiter en onmiddellijk na de onderliggende interstitiële cel (VIC) isolatie is eenvoudig.

Samenvatting

Hartkleppen zijn zelf verantwoordelijk voor het handhaven van een richting bloedstroom door het cardiovasculaire systeem. Deze dunne, vezelige weefsels worden blootgesteld aan grote mechanische belastingen als ze te openen en meerdere miljard keer dicht boven een levensduur. De ongelooflijke uithoudingsvermogen van deze weefsels is te wijten aan de bewoner valvulaire endotheel (VEC) en interstitiële cellen (VIC) die constant reparatie en renovatie in reactie op de lokale mechanische en biologische signalen. Pas sinds kort zijn we begonnen met het unieke gedrag van deze cellen, die in vitro experimenten heeft een belangrijke rol gespeeld te begrijpen. Een bijzondere uitdaging is de isolatie en de cultuur van VEC. Speciale zorg moet worden toegepast vanaf het moment dat het weefsel is verwijderd uit de host via finale plating. Hier presenteren wij protocollen voor directe isolatie, side specifieke isolement, cultuur, en verificatie van pure populaties van VEC. We maken gebruik van enzymatische vertering, gevolgd door een zachte doekje scraping techniek om alleen aan de oppervlakte cellen los te maken. Deze cellen worden vervolgens verzameld in een buis en gecentrifugeerd tot een pellet. De pellet wordt vervolgens geresuspendeerd en uitgeplaat in kweekflesjes pre-gecoat met collageen I matrix. VEC fenotype wordt bevestigd door contact remde de groei en de expressie van endotheliale specifieke markers, zoals PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), en negatieve expressie van alfa-gladde spiercel actine (α-SMA). De functionele eigenschappen van VEC geassocieerd zijn met hoge niveaus van LDL geacetyleerde. In tegenstelling tot de vasculaire endotheliale cellen, VEC hebben de unieke capaciteit om te zetten in mesenchym, die normaal optreedt tijdens de embryonale klep vorming van ^een. Dit kan ook optreden tijdens significant verlengd bericht samenvloeiende in vitro cultuur, dus zorg moeten worden geleverd om doorgang op of nabij samenvloeiing. Na het VEC isolatie, kan pure populaties van de VIC dan gemakkelijk worden verkregen.

Protocol

1. Voorbereiding

1. Autoclaaf in een overdekte instrument lade de volgende items:
   1. Gekartelde weefsel pincet - Voor de behandeling van de folder weefsel
   2. Tissue schaar (8 cm) - voor het snoeien van folder weefsel en knobbels
   3. Wattenstaafjes - Voor het isoleren van de endotheliale laag van de folder of cusp
2. Maak steriele collagenase oplossing
   1. Voeg 4,0 gram gemalen DMEM tot 250 ml van 18 MΩ water.
   2. Voeg 1,11 gram natriumbicarbonaat.
   3. Voeg (600 U / ml) 180.000 eenheden van collagenase.
   4. Voeg 1% (3 ml) penicilline / streptomycine.
   5. Breng de pH van de oplossing tot 7,2.
   6. Breng de oplossing tot 270 ml.
   7. Steriliseer de oplossing door het passeren door een 0,2 um filter.
   8. Voeg 10% (30ml) van steriele foetaal runderserum.
3. Maak steriel endotheelcellen medium
   1. Voeg 6,7 gram gemalen DMEM tot 400 ml van 18 MΩ water.
   2. Voeg 1,85 gram natriumbicarbonaat.
   3. Voeg (50 U / ml) 25.000 eenheden van heparine.
   4. Voeg 1% (5 ml) penicilline / streptomycine.
   5. Breng de pH van de oplossing tot 7,2.
   6. Breng de oplossing tot 450 ml.
   7. Steriliseer de oplossing door het passeren door een 0,2 um filter.
   8. Voeg 10% (50 ml) van steriele foetaal runderserum.
4. Maak steriel interstitiële celmedium
   1. Voeg 13.37 gram gemalen DMEM tot 800 ml van 18 MΩ water.
   2. Voeg 3,7 gram natriumbicarbonaat.
   3. Voeg 1% (10 ml) penicilline / streptomycine.
   4. Breng de pH van de oplossing tot 7,2.
   5. Breng de oplossing tot 900 ml.
   6. Steriliseer de oplossing door het passeren door een 0,2 um filter.
   7. Voeg 10% (100ml) van de steriele bovine serum.

2. Isolatie van Heart Valve Folders

1. Accijnzen van de aorta wortel onmiddellijk en aseptisch uit het hart na het offer.
2. Spoel de aorta wortel van het bloed met koud steriel DPBS. Het is noodzakelijk om alle bloedcomponenten zo snel mogelijk te verwijderen om VEC dood en bacteriële besmetting te beperken. Antibiotica en antimycotica worden afgeraden in dit stadium, omdat ze mogelijk schadelijk zijn voor het VEC.
3. Isoleer klepbladen (3 per klep) rechtstreeks vanaf de wortel en plaats in een steriele 15 ml conische buis gevuld met 12 ml koud DPBS. Schud enkele malen goed om vuil te verwijderen en vul met verse DPBS.
4. Vervoer terug naar het lab op het ijs.
5. Bij aankomst in het laboratorium, plaats de container met het weefsel onder de steriele kap.

3. Isolatie van endotheellaag

1. Vul een steriele 35mm schotel met 3 ml van de koude collagenase oplossing per ventiel (3 folders).
2. Plaats alle drie de folders uit de 15 mL buis in de schaal gevuld met de collagenase oplossing.
3. Incubeer het weefsel gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C.
4. Verwijder voorzichtig de endotheliale laag door het draaien van een droge steriele wattenstaafje op het oppervlak van de bijsluiter. De draairichting en de hoeveelheid afschuiving toegepast, is van cruciaal belang voor de zuiverheid van je monster. De rotatie van het staafje moet worden in een tegengestelde richting lineaire beweging van je hand het creëren van een gecontroleerde afschuiving. Deze afschuiving is wat tilt de endotheliale cellen van het weefsel. De hoeveelheid kracht die moet genoeg zijn om de weerstand van het weefsel te voelen, maar niet doordringen in de basale membraan.
5. Af en toe, schar het staafje binnen de collagenase oplossing om cellen van de tip vezels te verwijderen. Na het zwabberen is voltooid, moet de textuur van de endotheliale laag gevoel iets soepeler dan voorheen.
6. Verzamel de celsuspensie / collagenase en over te dragen aan een nieuwe steriele 15 ml buis.
7. Centrifugeer de buizen bij 1000 rpm gedurende 5 minuten te pellet een geïsoleerde cellen en zuig supernatans. Als het isoleren van interstitiële cellen ook, uit te voeren dat protocol, terwijl deze cellen worden gecentrifugeerd.
8. Voeg 3 ml van endotheliale varkens medium om de 15 ml buizen, centrifuge een tweede keer, en zuig media. Deze tweede centrifugatie helpt filteren een deel van de ongewenste materiaal, zoals vezels tip.
9. De gecentrifugeerde endotheelcellen opnieuw te schorten in 5 ml van endotheliale varkens medium en het bord van de cellen in een pre-coating T-25 kolf met collageen (gebruik een fles per centrifugebuis).
10. Laat de cellen ten minste 2-3 dagen te groeien voordat u de endotheliale medium. Dit helpt de cellen te herstellen en verdelen, omdat de isolatie proces is vrij hard en de cel opbrengst kan laag zijn. Het is van cruciaal belang om de passage cellen in de buurt samenloop sinds contact inhibitie zou kunnen leiden tot cel-transformatie.

4. De voorbereiding van 60 mm Cultuur Dish voor Side specifieke Isolation

1. Lijn van de 60 mm glazen petrischaaltjes met aluminiumfolie (2 glazen schalen per leaflet). De aluminiumfolie helpt bij het verwijderen van de paraffine, zodat het glas petrischaal kan worden hergebruikt voor andere isolaties.
2. Plaats paraffine kralen binnen de gerechten, ongeveer de helft vol, en dekking voor de autoclaaf.
3. Nadat de autoclaaf is voltooid en paraffine is gesmolten, zet de schotel ensemble naar een koele vlakke ondergrond. Als de paraffine afkoelt, zal het verharden en maak een laag die zal ondersteunen naald gaatjes.
4. Na 30 minuten kan de gesteriliseerde schotel vervolgens worden gebruikt als een isolatiekamer op de bijsluiter weefsel te immobiliseren.

5. Isolatie van Side Specifieke endotheellaag

1. Haal de folders uit de 15 ml tubes en leg ze op voorbereid 60mm cultuur schotel voor kant specifieke isolatie.
2. Manipuleer de bijsluiter, zodat de ventricularis zijde naar beneden gezicht op de paraffine oppervlak waardoor de fibrosa kant blootgesteld. Speld de randen van de folder aan de endotheliale laag bloot te leggen.
3. Leg een paar druppels koud collagenase op elk (naar boven gericht) endotheliale oppervlak en het weefsel gedurende 5-10 minuten incuberen bij 37 ° C.
4. Net als voorheen, verwijder voorzichtig de endotheliale laag door het draaien van een droge steriele wattenstaafje op het oppervlak van de bijsluiter. De draairichting en de hoeveelheid afschuiving toegepast, is van cruciaal belang voor de zuiverheid van je monster. De rotatie van het staafje moet worden in een tegengestelde richting lineaire beweging van je hand het creëren van een gecontroleerde afschuiving. Deze afschuiving is wat tilt de endotheliale cellen van het weefsel en niets anders. De hoeveelheid kracht die moet genoeg zijn om de weerstand van het weefsel te voelen, maar dringt niet door in het weefsel.
5. Af en toe, schar het staafje binnen de collagenase oplossing om cellen van de tip vezels te verwijderen. Na het zwabberen is voltooid, moet de textuur van de endotheliale laag gevoel iets soepeler dan voorheen.
6. Verzamel de celsuspensie / collagenase en over te dragen aan een nieuwe steriele 15 ml buis. Geef side specificiteit op het etiket (folders uit dezelfde klep kan worden gegroepeerd).
7. Overdracht van de folders om een ​​nieuwe cultuur schotel, zodat de ventricularis kant is nu bloot en herhaal de stappen (5.3 tot 5.6).
8. Zodra alle celsuspensie / collagenase wordt verzameld, centrifuge de buizen op 1000 rpm voor vijf minuten naar een pellet geïsoleerde cellen en zuig supernatans. Als het isoleren van interstitiële cellen ook, uit te voeren dat protocol, terwijl deze cellen worden gecentrifugeerd.
9. Voeg 3 ml van endotheliale varkens medium om de buizen, centrifuge een tweede keer, en zuig media. Deze tweede centrifugatie helpt filteren een deel van de ongewenste materiaal, zoals vezels tip.
10. De gecentrifugeerde endotheelcellen opnieuw te schorten in 5 ml van endotheliale varkens medium en het bord van de cellen in een pre-coating T-25 kolf met collage (gebruik een fles per centrifugebuis).
11. Laat de cellen ten minste 2-3 dagen te groeien voordat u de endotheliale medium. Dit helpt de cellen te herstellen en verdelen, omdat de isolatie proces is vrij hard. Als u merkt dat de opbrengst zeer laag, overwegen te verhuizen naar een kleinere fles of goed plaat sinds cel-cel adhesie bevordert de celgroei. Vergeet niet om passage in de buurt van samenloop, omdat contact inhibitie zou kunnen leiden tot cel-transformatie.

6. Isolatie van interstitiële cellen

1. Vul een steriele 15 ml centrifugebuis met 10 ml collagenase oplossing per ventiel (3 folders).
2. Na het zwabberen van het folders van endotheelcellen, direct plaats ze in de daarvoor bestemde 15 ml buis met de collagenase oplossing.
3. Incubeer gedurende ongeveer 12 tot 18 uur (Schud voorzichtig indien gewenst).
4. Meng de gedegradeerde weefsel met een serologische pipet tot celsuspensie / collagenase wordt gehomogeniseerd. Deze homogenisering helpt breken het weefsel en laat de interstitiële cellen.
5. Centrifugeer het verteerde weefsel gedurende 5 minuten bij 1000 rpm en zuig het supernatant.
6. Voeg 5 mL interstitiële varkens medium om de 15ml buizen, centrifuge een tweede keer, en zuig supernate.
7. De gecentrifugeerde endotheelcellen opnieuw te schorten in 5 ml van interstitiële varkens medium en het bord van de cellen in een T-75 kolf (gebruik een fles per centrifugebuis).
8. Laat de cellen ten minste 1-2 dagen te groeien voordat u de interstitiële cel medium. Er zal veel meer weefselstukjes dan met de endotheelcellen, maar dat is te verwachten zijn. De cellen moeten ook groeien tot samenvloeiing sneller dan de endotheelcellen als gevolg van de cel opbrengst en hun aard.

7. Vertegenwoordiger Images

Figuur 1. De morfologie van geïsoleerde cellen op 2-3 dagen na de isolatie. (A) VEC vertonen een typische endotheel-morfologie en vormen clusters om de groei te bevorderen. (B) VIC morfologie is vergelijkbaar met myofibroblasten die in het algemeen spindel gevormd en gelijkmatig verspreid over de kolf.

Figuur 2. De morfologie van geïsoleerde cellen op confluentie. (A) VEC vertonen een typische morfologie endotheelcellen die in het algemeen kasseien en de groei contact geremd. (B) VIC morfologie is vergelijkbaar met myofibroblasten die in het algemeen spindel gevormd en niet de groei contact geremd.

Figuur 3. De functie kenmerken van geïsoleerde cellen ^6. (A) VEC geassocieerd zijn met hoge niveaus van LDL geacetyleerde opname (rood). (B) VIC worden geassocieerd met lage niveaus van LDL geacetyleerde opname.

Figuur 4. Cellular markers van de geïsoleerde cellen ^6. (A) VEC fenotype is bijgedragen aan een positieve kleuring voor Von Willebrand Factor (groen), blauw (kernen). (B) VIC fenotype is bijgedragen aan een negatieve kleuring voor Von Willebrand Factor.

Figuur 5. Cellulaire markers van geïsoleerde cellen. (A) VEC fenotype is bijgedragen aan de negatieve kleuring voor alfa SMA (groen), blauw (kernen). (B) VIC fenotype is bijgedragen aan de positieve kleuring voor alfa SMA.

Dissociatie Agent	Dissociatie Techniek	Cel Collection	Cel Hoeveelheid	Cel Zuiverheid	Besmetting
EDTA (3mm) zonder CaCl 2	5, 20, 60 minuten. voordat CaCl 2 naast	20, 60, 120 minuten. voor de collectie	-	+ / -	+ + +
EDTA (6mm) zonder CaCl 2	5, 20, 60 minuten. voordat CaCl 2 naast	20, 60, 120 minuten. voor de collectie	+ / -	+	+ + +
Trypsine-EDTA (0,5 g / L)	5, 10, 15 minuten. voor deactivatie	Medium verzameld onmiddellijk	+	+	+ +
Collagenase II (300 U / ml)	5, 10, 15 minuten. voor deactivatie	Medium verzameld onmiddellijk	-, +, + +	-, + +, +	+
Collagenase II (600 U / ml)	5, 10, 15 minuten. voor deactivatie	Medium verzameld onmiddellijk	+, + +, + + +	+ +, + +, -	-

Tabel 1. Resultaten van een verkennend valvulaire endotheelcellen geïsoleerd protocollen.

Discussie

Een begrip van valvulaire biologie is aangetast door de technische problemen te isoleren en kweken van zuivere populaties van valvulaire endotheelcellen. Typische isolatietechnieken betrekken enzymatische vertering van de onderliggende basale matrix of chemische dissociatie van endotheliale lijmverbindingen ^2,3. Voorlopige isolatie experimenten werden kwalitatief onderzocht door het variëren van dissociatie agenten en incubatietijd. De resultaten van deze experimenten toonden aan dat EDTA (of trypsine-EDTA) i...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Mediatech, Inc.	50-103-PB
Foetaal runderserum	GIBCO, by Life Technologies	26140
Penicilline Streptomycine	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
0.25% Trypsine-EDTA	GIBCO, by Life Technologies	25200
Heparine natriumzout	Sigma-Aldrich	H4784-1G
Collagenase Type 2	Worthington Biochemical	LS004176
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	21300-058
Rattenstaartcollageen	BD Biosciences	354236
Critical Swabs	VWR international	89031-270
Natriumbicarbonaat	Sigma-Aldrich	55761
T25 kolfen	BD Biosciences	353018
T75 kolfen	BD Biosciences	353136
24-wells plaat	Falcon BD	353047
60x15 mm schaaltjes	VWR international	25384-092
60x15 glazen schaaltjes	VWR international	89000-310
Paraffine inbeddingswas	Electron Microscopy Sciences	19304-01
Precision Glide naalden	BD Biosciences	305165
500 mL Nalgene filters	VWR international	73520-985
1L Nalgene filters	VWR international	73520-986
Weefselpincet	Fine Science Tools	11023-15
FSC pincet #5	Fine Science Tools	11295-00