Bereiding van zeer Gekoppeld Rat Hart Mitochondriën

Samenvatting

We beschrijven а protocol voor isolatie van pure, sterk gekoppeld rat hart mitochondriën voor functionele of structurele studies van cellulaire bio-energetica, biofysische metingen, proteomics of mitochondriale DNA en lipiden-analyse.

Samenvatting

De functie van mitochondriën in generatie van cellulaire ATP in het proces van oxidatieve fosforylering wordt algemeen erkend. In de afgelopen decennia zijn er aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van de functies van de mitochondria andere dan de opwekking van energie. Deze omvatten hun rol in apoptose, als signalering organellen, zoogdieren ontwikkeling en veroudering en hun bijdrage aan de coördinatie tussen de celstofwisseling en celproliferatie. Ons begrip van biologische processen gemoduleerd door mitochondriën is gebaseerd op de robuuste methoden voor isolatie en behandeling van intacte mitochondriën van weefsels van de proefdieren. Mitochondriën van de rat hart is een van de meest voorkomende voorbereidingen voor het verleden en de huidige studies van cellulaire metabolisme inbegrip van studies naar knock-out dieren.

Hier beschrijven we een gedetailleerde snelle methode voor isolatie van intact mitochondria met een hoge mate van koppeling. Een dergelijke voorbereiding van de rat hart mitochondriën is een uitstekend object voor functionele en structurele onderzoek naar cellulaire bio-energetica, transport van biomoleculen, proteomische studies en analyses van mitochondriaal DNA, eiwitten en lipiden.

Protocol

Introductie

Mitochondriën van de rat hart is een van de meest voorkomende voorbereidingen voor het verleden en de huidige studies van cellulaire metabolisme. Ze kunnen snel en betrouwbaar worden verkregen in grote hoeveelheden uit wild type of knock-out dieren. De algemene procedure bestaat uit weefsel spijsvertering door trypsine, fractionering en differentieel centrifugeren.

Er zijn verschillende voorwaarden waaraan moet worden gehouden tijdens de Isolatie van mitochondriën uit verschillende weefsels, waaronder het hart (afb. 1).

• Het weefsel moet grondig worden gehakt, omdat het rechtstreeks van invloed op de opbrengst van de verkregen mitochondriën. Hartweefsel is het beste te blad voor de mond met kleine gebogen schaar en kan gevolgd worden door gebruik van een slijpmachine Latapie tissue of, indien een weefsel slijpmachine niet beschikbaar is, een knoflook pers met afvoer gaten met een diameter van ongeveer 1,0 mm diameter.
• Het is noodzakelijk om de temperatuur van oplossingen te houden bij elke stap. Daarom is de hele procedure moet worden uitgevoerd in een koude kamer en alle instrumenten en oplossingen moeten worden opgesteld en gekoeld op voorhand. Als de temperatuur niet stabiel verschillende eigenschappen van het preparaat kan worden verloren. Mitochondriale structuur is erg gevoelig voor bevriezing, zodat overfreezing van de ophanging (bijvoorbeeld tijdens het centrifugeren) is niet toegestaan, zeker als studies van actief transport zijn belangrijk.
• Een belangrijke parameter is de tijd-duur van de procedure, de isolatie moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd en de verkregen voorbereiding moet onmiddellijk worden gebruikt. Daarom, chirurgische instrumenten, oplossingen en apparaten moeten worden voorbereid op voorhand.

Materialen en instrumenten

Instrumenten

1. Rechte operationele schaar, scherpe punt
2. Gebogen schaar
3. Pincet
4. Petrischaal
5. Kleine trechter + stuk nylon filter (voorwas)
6. 6 bekers 50 ml
7. Twee magnetische roerders en twee baden ijs
8. Een grote ijsbad
9. 2 kleine magneetstaven
10. Spatels voor pellet schrapen
11. Centrifugebuisjes
12. Latapie weefsel drukt u op (kan worden vervangen met knoflook pers)
13. Teflon-glas homogenisatoren 20 ml en 1-2ml
14. Afval beker
15. Eppendorf buisjes voor de laatste mitochondriale schorsing en monsters voor eiwitbepaling
16. Ijs baden

Oplossingen (berekend per 2 ratten):

1. Wasbuffer: 0,3 M sucrose, 10 mM HEPES (pH = 7,2), 0,2 mM EDTA (1000 ml)
2. Isolatie buffer: 0,3 M sucrose, 10 mM HEPES (pH = 7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg / ml BSA (Sigma A6003) (100 ml bereid uit de wasmachine buffer). Bovine serum albumine kan worden vervangen door minder dure vetzuur-vrij analogen. Dezelfde buffer of een isotone variaties kan worden gebruikt als buffer mengen.
3. Trypsine (Sigma T8003) oplossing: 2.5mg/ml in 1 mM HCl (0,5 ml)
4. Trypsine-remmer van soja bonen (Sigma T9128) 6,5 mg/10 ml Isolatie buffer

Protocol

De algemene opzet van de procedure wordt getoond op Fig. 1. Hearts moet worden gekoeld en gewassen in Wassen buffer, ventriculaire weefsel weggesneden, gehakt en gehomogeniseerd tijdens de fotolytische de behandeling met trypsine. De suspensie wordt gecentrifugeerd op lage snelheid en de verkregen supernatant wordt opnieuw gecentrifugeerd bij een hogere snelheid te verzamelen mitochondriën. Afhankelijk van de geplande experimenten de resuspenderen buffer kan worden vervangen door een andere isotone oplossing.

Dieren werden beëindigd in overeenstemming met het Verenigd Koninkrijk "Dieren (wetenschappelijke procedures) wet." door cervicale dislocatie, gevolgd door onthoofding. Het is noodzakelijk om het hart extract onmiddellijk na onthoofding van het dier, zodat er geen vertraging tussen dier beëindiging en hart extractie. Als parallel isolatie van de lever mitochondriën wordt verwacht dat de ratten 's nachts moet worden gevast voorafgaand aan het experiment.

1. Bereid drie bekerglazen met 40 ml wasbuffer. Koel ze in het ijs-zoutbad voor 3 tot 5 minuten voordat u verder gaat met de volgende stap. Zorg ervoor dat ze niet te overfreeze en direct net na wolken van ijskristallen beginnen te verschijnen te gebruiken.
2. Open de thorax van de onthoofde rat en extract het hart. Maak kleine incisies en direct daarna het hart naar de ijskoude oplossing in de eerste beker. Knijp het hart om bloed te verwijderen en zet het in de tweede beker. Herhaal deze handeling voor elk hart.
3. Droog de harten op het filtreerpapier. Verwijder alle vet, geronnen bloed, boezems en fasciae en het zwembad van het ventriculaire weefsel.
4. Hak de gepoolde weefsel met kleine gebogen schaar op de petrischaal op ijs voor ongeveer 5 minuten tot de grootte van de deeltjes is ongeveer 1-2 mm.
5. Doe het gehakt weefsel in het weefsel pers en passerenhet door. Wees ervan bewust dat een aanzienlijke hoeveelheid van het materiaal kan blijven in de pers, zodat al het hartweefsel te halen bij de wanden en de bodem van de pers.
6. Overdracht van het materiaal in het bekerglas met 50 ml wasbuffer en roer. Filteren dan de suspensie door middel van een nylon filter. Was het gehakt weefsel op het filter 3 keer met de wasbuffer en gooi het filtraat.
7. Breng de gewassen weefsel in 20 ml wasbuffer en plaats deze in het ijsbad op de magneetroerder. Voeg 0,5 ml trypsine-oplossing onder voortdurend roeren en start de timer. Bereid een andere magneetroerder, ijsbad en een tweede 50 ml beker.
8. Op de 4 ^e minuut kort homogeniseren van de schorsing gedeelte met behulp van een klein gedeelte los gemonteerd glas-Teflon homogenisator (10-15ml) met een aantal op en neer slagen om de schorsing te verspreiden. Na homogenisering overdracht van de suspensie in de tweede beker. Herhaal de procedure op de 9 ^e minuut, zodat u de homogenisering van de schorsing twee keer uit te voeren in totaal. Na 15 min incubatie, voeg 10 ml van het isoleren van buffer met trypsine-remmer en incubeer gedurende 1 minuut.
9. Nogmaals filteren de suspensie door een nylon filter en sla het filtraat. Verzamel de fractie deeltjes links op een filter en homogeniseren gedurende 1 minuut in 15-20 ml wasbuffer.
10. Combineer de homogenaat met het filtraat en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 600g.
11. Voorzichtig filter de resulterende supernatant in een nieuwe centrifugebuis. Voorkom besmetting door de pellet en centrifuge opnieuw gedurende 15 minuten bij 8500g.
12. Na de hoge snelheid centrifugeren Verwijder het supernatant en spoel de pellet 2-3 keer met 1 ml van de buffer het teruggooien van het pluizige witte buitenrand laag. Breek de pellet met de spatel, maar vermijd de rode vlek van erytrocyten aan de onderkant. Als de bloedcellen kreeg Loos, verwijder de rode stukjes van de schorsing voor de homogenisering.
13. Resuspendeer de pellet met een kleine homogenisator of anders door zachte pipetteren. Verdunnen de suspensie met meer Isolationbuffer en centrifugeer weer gedurende 15 minuten bij 8500g.
14. Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in mengen Buffer (een isotone buffer naar keuze) en centrifugeer opnieuw.
15. De resulterende bruine pellet bevat gewassen intact mitochondriën. Resuspendeer de pellet in een zeer kleine hoeveelheid isotone buffer van uw keuze.

Figuur 1. Schema het aantonen van de procedure stap voor stap het isolement van de rat hart mitochondriën. Bovenste gedeelte, Podia 1-9: weefsel verstoring, trypsine behandeling en homogenisering, onderste deel, podia 10-15: differentieel centrifugeren.

Discussie

Gedetailleerde snelle protocol voor isolatie van intact mitochondria met een hoge mate van koppeling wordt beschreven. Verkregen preparaat kan worden gebruikt voor functionele of structurele onderzoek op cellulaire bio-energetica, proteomische studies of analyses van mitochondriaal DNA en vetten. Biofysische studies van het actief transport van ionen en metabole intermediairen kunnen ook worden uitgevoerd. Het is mogelijk om verder te verwerken van de mitochondriale voorbereiding om submitochondrial deeltjes, buitenste membraan of te zuiveren afzonderlijke componenten van oxidatieve fosforylering isoleren. De beschreven werkwijze is een modificatie van het standaard protocol van de isolatie door Jacobus en Saks ^1. De verwachte opbrengst van de bereide mitochondriën is ongeveer 10-15 mg van mitochondriaal eiwit per hart en de luchtwegen controle verhouding op malaat / glutamaat van deze bereiding, varieert tussen de 8 en 12 met State IV ademhaling van rond de 0,12 mmol O ₂ xmin ^-1 XMG eiwit ¹ bij 23 ° C in het medium, bestaande uit 0,25 M sucrose, 10 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 5 mM kaliumfosfaat (pH 8,0) met 150 uM ADP voor initiatie staat III ademhaling (voor de exacte experimentele condities en aanvullingen, zie ref . ^2).

Speciale aandacht moet worden besteed aan enkele technische details voor de start van de isolatie procedure. Het is cruciaal om schoon polycarbonaat of polypropyleen centrifugebuizen gebruik, dus buizen moeten grondig gewassen worden met een schone borstel en warm water, maar het wasmiddel behandeling moet worden gehandhaafd op het minimum. Ook is het beter om alle nodige glaswerk en instrumenten verzamelen in de koude kamer een dag voor de isolatie.

Tijdens de isolatie bij het overbrengen van buffers van kolven tot bekers, moet а speciale aandacht worden besteed aan de druppels ijswater te voorkomen in de oplossingen. Bij het hanteren van weefsels moet worden benadrukt dat het hart-extractie moet worden uitgevoerd zo snel mogelijk, omdat zelfs de korte vertraging tussen de onthoofding van het dier en het afkoelen van het weefsel zou resulteren in gedeeltelijk ontkoppelde mitochondria. Snelle afkoeling en grondig wassen van verwijderd harten is essentieel voor standaard voorbereiding, vrij van hemoglobine en erytrocyten NADase te verkrijgen.

Trypsine wordt gebruikt voor het bindweefsel eiwitten degradatie van de gevoeligheid van het weefsel te verhogen tot afschuifkracht tijdens het homogeniseren. Langdurige blootstelling van het weefsel te protease dient te worden vermeden, omdat het resulteert in mitochondria van inferieure kwaliteit.

Na de hoge snelheid centrifugations de wanden van de centrifuge buizen moeten worden afgeveegd met tissue papier om alle deposito's van vet materiaal verzameld op de muren te verwijderen.

Voor de uiteindelijke resuspensie is het beter om een ​​laag volume van de laatste buffer te gebruiken om verlies te minimaliseren van mitochondriale functies tijdens opslag (150 tot 200 ul van de buffer per hart). Voor studies van het transport van tweewaardige kationen geen chelaatvormers moet aanwezig zijn in de laatste voorbereiding dus mitochondria moet worden gewassen voor meerdere malen met EGTA-vrij medium en gebruikt binnen de eerste uren na isolatie.