Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Kwantificering van de Th-1 cellulaire immuunreacties tegen microbiële antigenen

Samenvatting

Identificatie van microbiële doelstellingen van adaptieve immuniteit in idiopathische ziekte kan worden bewerkstelligd door het gebruik van het enzym-linked immunospot assay.

Samenvatting

Adaptive immuniteit is een belangrijk onderdeel van de klaring van intracellulaire pathogenen. De mogelijkheid om te detecteren en kwantificeren van deze reacties bij de mens is een belangrijk diagnostisch hulpmiddel. Het enzym-linked immunospot assay (ELISPOT) wint aan populariteit om zijn vermogen om cellulaire immuunresponsen te identificeren tegen microbiële antigenen, waaronder immuunsysteem populaties zoals die met HIV-infectie, transplantatie, en het gebruik van steroïden. Deze test heeft de capaciteit om de immuunrespons tegen specifieke microbiële antigenen, evenals onderscheiden of deze reacties zijn Th1 of Th2 van karakter te kwantificeren. ELISPOT is niet beperkt tot de plaats van de ontsteking. Het is veelzijdig in zijn vermogen om te beoordelen voor de immuunrespons in het perifere bloed, maar ook als gebieden van actieve betrokkenheid, zoals bronchoalveolaire lavage, cerebrospinale vloeistof, en ascites. Detectie van immuunresponsen gericht tegen een of meerdere antigenen is mogelijk, evenals specifieke epitopen binnen de microbiële eiwitten. Deze test maakt detectie van immuunreacties in de tijd, evenals verschillen in antigenen herkend door gastheer T-cellen. Tweekleurige ELISPOT-tests zijn beschikbaar voor de detectie van gelijktijdige expressie van twee cytokines. Recente toepassingen voor deze techniek onder de diagnose van extrapulmonale tuberculose, evenals onderzoek naar de bijdrage van besmettelijke antigenen aan auto-immuunziekten.

Protocol

Voor de volgende protocol maken we gebruik van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) als de cellen van belang. Dit kan echter protocol worden gebruikt met andere celtypen. Voer de test in een weefselkweek kap met steriele techniek.

Dag 1: Voorbereiding van Plate en cellen

1. Neem een ​​ELISPOT bord en open het in de motorkap.
2. Was de plaat 3 maal met 150 ul van 1X PBS met behulp van een multichannel pipet, indien beschikbaar, anders een goed pipetteren aanvaardbaar is.
3. Neem een ​​pakket van reservoirs en open het in de motorkap.
4. Voeg 2 ug / ml van de capture antilichaam, anti-humaan interferon-γ, tot 11 ml van 1X PBS. Vortex goed. Overdracht antilichaam meng tot een reservoir.
5. Plaats 100 pl van de coating oplossing in elk putje met behulp van de meerkanaals.
6. Wikkel de plaat in parafilm.
7. Plaats de plaat in de koelkast overnachten. De platen zijn goed voor weken. De vuistregel is dat als er nog vloeistof die overblijft in de putten, de plaat kan worden gebruikt.

Celpreparaat

Als de PBMC's vers zijn dan de telling van de cellen en incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO _2. Voor de PBMC opgeslagen in vloeibare stikstof, ontdooien van de cellen nodig is. Het protocol is als volgt:

1. Ontdooi de cryovial van cellen in 37 ° C waterbad tot bijna helemaal ontdooid.
2. Onmiddellijk opnieuw in suspensie in 5 ml van de R10 media.
3. Spin gedurende 5 minuten bij 225 x g.
4. Resuspendeer weer in 5 ml R10 media en tel de levensvatbare cellen met behulp van trypan blauw.
5. Breng concentratie 2 x 10 ⁶ cellen / ml in R10 media.
6. Rust 's nachts bij 37 ° C met 5% CO _2.

Dag 2: Opstarten van de Plate

1. Label plaat deksel met het monster identificatienummer, goed omstandigheden, en de datum.
2. Was de plaat 6 keer met 150 ul van steriele 1x PBS met behulp van de dump en de blot-methode. Wees voorzichtig niet om de plaat te spatten tijdens het dumping. Dit kan ertoe leiden dat de putjes van de plaat te draaien paars.
3. Voeg 100 ul van R20 aan elk putje.
4. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 1 uur.
5. Terwijl de plaat is incuberen, tel de cellen die 's nachts werden uitgerust.
6. Spin de celsuspensie bij 1500 rpm gedurende 5 minuten. Giet het supernatant en resuspendeer de pellet, zodat je een uiteindelijke concentratie van 1x10 ⁶ cellen per 1 ml in R10 media.
7. Na 1 uur incubatie, verwijder de R20 met de dump en de blot-methode. Wees voorzichtig niet om de plaat te spatten tijdens het dumping.
8. Voeg 100 ul van cel-oplossing (10 ⁵ cellen) aan elk putje. Voeg het juiste peptiden en / of antigenen om de corresponderende putten in tweevoud. Gebruik een nieuwe pipettip elke keer dat je in de peptide-werkende oplossing. Normale peptide concentratie is 10-40 ug / ml. Sinds peptiden verschillen, moet iedere onderzoeker titreren peptiden om optimale resultaten te verkrijgen.
9. In de negatieve controle putten, alleen maar cellen (geen peptiden)
10. In de positieve controle putten, toe te voegen fytohemagglutinine (PHA, 10 ug / ml; Sigma).
11. Incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO ₂ (~ 18 uur).

Dag 3: Ontwikkeling van de Plaat

1. Was de plaat 6 keer met 150 pi 1xPBS het gebruik van de dump en de blot-methode.
2. Voeg 100 ul PBS aan elk putje van de plaat met behulp van de multichannel pipet.
3. Zet de plaat in de koelkast gedurende 15 minuten.
4. Haal de plaat uit de koelkast en plaats deze in de weefselkweek kap.
5. Bereid de biotine antilichaamoplossing
   • Voeg 0,5 ug / ml van biotine antilichamen (MAB 7-B6-1) tot 11ml PBS.
   • Vortex de oplossing om goed te mengen.
   • Als u van plan om de oplossing toe te voegen met behulp van een multichannel, giet het in een reservoir.
6. Gooi de PBS door flicking het in de prullenbak. Wees voorzichtig niet om de plaat te spatten tijdens het dumping.
7. Plaats 100 pi van de oplossing in elk putje.
8. Incubeer de plaat in de weefselkweek kap bij kamertemperatuur gedurende een uur.
9. Was de plaat 6 keer met 150μL 1xPBS het gebruik van de dump en de blot-methode. Op de 6 ^e wassen, laat het PBS op de plaat tot u bereid de Streptavidine antilichaam.
10. Bereid de Streptavidine antilichaam.
    • Voeg 5,5 μ l Streptavidine antilichaam (streptavidine-ALP) naar 11ml PBS (1:2000 verdunning).
    • Vortex de oplossing om goed te mengen.
    • Als u van plan om de oplossing toe te voegen met behulp van een multichannel, giet het in een reservoir.
11. Gooi de PBS die nog in de putten en dep de plaat.
12. Voeg 100 ul van Streptavidine oplossing voor elk putje.
13. Incubeer de plaat in de weefselkweek kap bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
14. Spoel de platen 6 keer met PBS met behulp van de dump en de blot-methode. Op de 6 ^e wassen, laat het PBS op de plaat totdat je hebt gemaakt van de kleur oplossing.
15. Werken in het donker. De voorbereiding van de alkalische fosfatase substraat oplossing (alkalische fosfatase Substrate Kit IV BCIP / NBT):
    • Voeg 4 druppels substraat Reagens 1 tot 11 ml Tris-buffer, vortex goed. Voeg 4 druppels van substraat reagens 2 tot en met Tris-buffer, vortex goed. Voeg 4 druppels van substraat reagens 3 tot en met Tris-buffer, vortex goed.
16. Gooi de resterende PBS en dep de plaat.
17. Voeg 100 ul van de kleur-oplossing in elk putje van de plaat met behulp van de multichannel.
18. Doe het licht aan na 5 tot 10 minuten van kleur te ontwikkelen.
19. Laat de kleur reagentia te blijven op het bord tot aan de vlekken beginnen te draaien paars en zijn heel donker. Dit moet ergens van 5 tot 20 minuten. Wees voorzichtig niet aan de ondergrond oplossing te laten staan ​​te lang, want dit kan hoge achtergrond veroorzaken.
20. Was de ELISPOT plaat 3 maal met kraanwater.
21. Laten drogen voor ongeveer een uur of 's nachts.
22. Lees plaat manueel of met ELISPOT plaat lezer.
23. Bewaar de plaat in een doos uit de buurt van blootstelling aan licht.

Representatieve resultaten:

ELISPOT is ontworpen om immuunrespons kwantificeren tegen microbiële antigenen. Elke plek markeert een afzonderlijke responsieve cel, de uiting van de cytokine van belang. De vlekken kunnen handmatig of met behulp van een ELISPOT plaat lezer worden geteld.

Beoordeling dat de ELISPOT correct is uitgevoerd zou moeten beginnen met het onderzoek van de negatieve controle voor de achtergrond de productie van het cytokine van belang. In de negatieve controle putten men zou verwachten dat geen vlekken te zien, hoewel een beetje achtergrond (paarse kleur) aanwezig kunnen zijn. Normaal gesproken, zou er minder dan een gemiddelde van vijf spots per goed. De positieve controle putten te bevestigen dat de reactie correct is uitgevoerd en dat de cellen reageren op antigene stimulatie. In de positieve controle wells je zou verwachten dat een diep paarse achtergrond te wijten aan een samenloop van spots (Afb. 1) te zien. Er moeten weinig tot geen witte achtergrond. Als de positieve controle en negatieve controlemonsters geschikt zijn, kan men dan tellen de putten met het antigeen van belang. Een "niet optimaal" resultaat zou worden weerspiegeld door de hoge achtergrond (de putten zijn paars), geen vlekken of zeer weinig vlekken, leeg centrum, slecht gedefinieerde plekken of confluent vlekken. Een lijst met tips wordt voorzien (tabel 1).

Figuur 1. Een vertegenwoordiger van ELISPOT plaat. Elke plaat moet een positieve controle, negatieve controle en peptide van interesse uitgevoerd op het minimum in twee putten. C9, C10, D9 en D10 zijn de positieve controle putten, zoals je kunt zien is er een diep paarse kleur, samenvloeiende cellen en nauwelijks een witte achtergrond. De negatieve controle putten zijn G11, G12, H11 en H12. Deze putten hebben geen paarse achtergrond en geen vlekken zoals verwacht. De vlekken G7, G8, H7 en H8, illustreren cellulaire reacties op microbiële peptiden, de paarse vlekken vormen een reagerende cel die het cytokine van belang.

Tabel 1

Observatie	Mogelijk probleem	Mogelijke oplossing
Hoge achtergrond	1. Beide zijden van membraan niet goed gewassen 2. Te veel cellen afscheiden cytokine 3. Plaat niet gedroogd goed 4. Over ontwikkelde plaat	1. Was beide zijden van het membraan met gedestilleerd water voor en na de kleur ontwikkeling. Reagentia kunnen lekken door het membraan in de basis van de plaat, en deze kunnen hoge achtergrond veroorzaken als niet weggespoeld. 2. Vermindering van het aantal cellen per well, zal dit vereisen optimalisatie 3. Droog de plaat langer voordat het lezen van 4. Verminderen het ontwikkelen van de tijd
Geen vlekken / Zeer weinig Spots	1. Niet genoeg cellen afscheiden cytokine / eiwit van belang 2. Zorg ervoor dat de cellen juist gestimuleerd 3. Cellen die niet geïncubeerd long genoeg of kan de tijd nemen om te reageren op stimulerende 4. Onvoldoende kleurontwikkeling 5. Niet genoeg primaire of secundaire antilichaam	1. Verhoog het aantal cellen. Dit vereist optimalisatie 2. Gebruik ook een positieve stimulans controle - een stimulerend middel dat je weet dat expressie van je cytokine / eiwit van belang veroorzaken 3. Verhoog de cel incubatietijd of gebruik de indirecte methode (pre-behandelen cellen met stimulerende) 4. Monitor kleurontwikkeling met een overhead microscoop en ervoor te zorgen dat de zich ontwikkelende reagentia correct zijn opgeslagen en zijn niet verloren activiteit 5. Concentratie van de primaire en / of secundaire antilichaam zal moeten worden verhoogd. Dit vereist optimalisatie.
Lege Gebieden	1. Membraan niet voorbehandeld 2. Membraan droog is op enig moment 3. Cellen ongelijk verdeeld	1. Zorg ervoor dat membraan is voldoende voorbehandeld met 70% ethanol (alle membranen dit niet nodig dus contact op met uw leverancier). Goed te wassen met PBS 3X achteraf 2. Zorg ervoor dat membraan niet droog 3. Zorg ervoor dat u voorzichtig mengen de cellen om een ​​goede homologe celsuspensie hebben voordat pipetteren uit in de putten
Blanco Center	1. Schade door het wassen	1. Debiet op de automatische wasmachine (of pipetteren) kan te hoog zijn. Behoefte aan een meer zachte wasprocedure
Valse positieven	1. Secundair antilichaam aggregaten 2. Cellen nog op het membraan 3. Celcultuur verontreiniging	1. Filter het secundaire antilichaam 2. Zorg ervoor dat alle cellen worden gewassen van het membraan met PBS Tween 20 voor de secundaire antilichaam incubatie. Cellen links op het membraan zal geven onregelmatig gevormde vlekken 3. Houden reagentia zo steriel en schoon mogelijk. Zorg ervoor dat uw celcultuur techniek aseptische is. Controleren op valse positieven door het uitvoeren van een media-negatieve controle. Voor de plaat beweging, zie de slecht gedefinieerde plekken
Confluent Spots	1. Slechte coating, te veel antilichaam 2. Langdurige celcultuur 3. Cellen over-gestimuleerde	1. Het primaire antilichaamconcentratie 2. Hoe langer de cellen worden geïncubeerd, des te meer cytokine / eiwit ze zullen afscheiden. Dit zal resulteren in grotere vlekken die zal beginnen samen te voegen en niet te onderscheiden te worden. 3. Verminder celcultuur stap incubatietijd. Over-stimulatie zal resulteren in een veel cytokine / eiwit wordt afgescheiden door de cel. Dit zal plekjes die zal beginnen samen te voegen en niet te onderscheiden te worden. Verminder de hoeveelheid van stimulantia in de cultuur media of de cultuur voor een kortere tijd
Slecht gedefinieerd Spots	1. Membraan niet voorbehandeld (indien uw membraan dit vereist, contact op met de leverancier) 2. Plaatbeweging tijdens de celdeling incubatie	1. Het membraan moet worden voorbehandeld met ethanol of dit kan leiden tot vage, slecht gedefinieerd plekken. Het zal moeilijk zijn voor de lezer om deze te onderscheiden 2. Sta niet toe dat de plaat te bewegen tijdens de celdeling incubatie als cellen die zijn verhuisd zal meer dan een plek te creëren. Indien mogelijk gebruik maken van een speciale couveuse die niet zal worden geopend tijdens de incubatie. Tik niet op de plaat na het toevoegen van cellen
Positieve controle putten is laag	1. Onderontwikkeling - kan een gevolg van het gebruik Streptavidine-ALP en / of BCIP / NBT oplossingen die niet zijn op kamertemperatuur gebracht worden	1. Breng reagentia op kamertemperatuur voordat u aan de wells
Dichtheid van de spots is het moeilijk te kwantificeren	1. Te veel cellen werden toegevoegd aan de wells	1. Maak verdunningen van cellen (dat wil zeggen, 1 x 10 6, 5 x 10 5, 1 x 10 5, 5 x 10 4, 1 x 10 4 cellen per well) om het optimale aantal cellen die zal resulteren in de vorming van verschillende plekken te bepalen

Discussie

De ELISPOT assay heeft ontpopt als een van de belangrijkste en meest gebruikte testen om te controleren immuunrespons bij de mens en een verscheidenheid aan andere soorten. Met de ELISPOT-test, kan het immuunsysteem cel frequenties worden gemeten aan de enkele cel niveau zonder uitbreiding of manipulatie van celpopulaties. ELISPOT test is op grote schaal toegepast om antigeen specifieke immuunrespons te onderzoeken in verschillende ziekten, waaronder infecties, kanker, allergieën en auto-immuunziekten. De toepassing van...

Materialen