Methodenartikel

Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Kwantificering van de Th-1 cellulaire immuunreacties tegen microbiële antigenen

DOI:

10.3791/2221

⸱

23 november 2010

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Microbiology and Immunology, Vanderbilt University School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identificatie van microbiële doelstellingen van adaptieve immuniteit in idiopathische ziekte kan worden bewerkstelligd door het gebruik van het enzym-linked immunospot assay.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adaptive immuniteit is een belangrijk onderdeel van de klaring van intracellulaire pathogenen. De mogelijkheid om te detecteren en kwantificeren van deze reacties bij de mens is een belangrijk diagnostisch hulpmiddel. Het enzym-linked immunospot assay (ELISPOT) wint aan populariteit om zijn vermogen om cellulaire immuunresponsen te identificeren tegen microbiële antigenen, waaronder immuunsysteem populaties zoals die met HIV-infectie, transplantatie, en het gebruik van steroïden. Deze test heeft de capaciteit om de immuunrespons tegen specifieke microbiële antigenen, evenals onderscheiden of deze reacties zijn Th1 of Th2 van karakter te kwantificeren. ELISPOT is niet beperkt tot de plaats van de ontsteking. Het is veelzijdig in zijn vermogen om te beoordelen voor de immuunrespons in het perifere bloed, maar ook als gebieden van actieve betrokkenheid, zoals bronchoalveolaire lavage, cerebrospinale vloeistof, en ascites. Detectie van immuunresponsen gericht tegen een of meerdere antigenen is mogelijk, evenals specifieke epitopen binnen de microbiële eiwitten. Deze test maakt detectie van immuunreacties in de tijd, evenals verschillen in antigenen herkend door gastheer T-cellen. Tweekleurige ELISPOT-tests zijn beschikbaar voor de detectie van gelijktijdige expressie van twee cytokines. Recente toepassingen voor deze techniek onder de diagnose van extrapulmonale tuberculose, evenals onderzoek naar de bijdrage van besmettelijke antigenen aan auto-immuunziekten.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor de volgende protocol maken we gebruik van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) als de cellen van belang. Dit kan echter protocol worden gebruikt met andere celtypen. Voer de test in een weefselkweek kap met steriele techniek.

Dag 1: Voorbereiding van Plate en cellen

  1. Neem een ​​ELISPOT bord en open het in de motorkap.
  2. Was de plaat 3 maal met 150 ul van 1X PBS met behulp van een multichannel pipet, indien beschikbaar, anders een goed pipetteren aanvaardbaar is.
  3. Neem een ​​pakket van reservoirs en open het in de motorkap.
  4. Voeg 2 ug / ml van de capture antilichaam, anti-huma....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ELISPOT assay heeft ontpopt als een van de belangrijkste en meest gebruikte testen om te controleren immuunrespons bij de mens en een verscheidenheid aan andere soorten. Met de ELISPOT-test, kan het immuunsysteem cel frequenties worden gemeten aan de enkele cel niveau zonder uitbreiding of manipulatie van celpopulaties. ELISPOT test is op grote schaal toegepast om antigeen specifieke immuunrespons te onderzoeken in verschillende ziekten, waaronder infecties, kanker, allergieën en auto-immuunziekten. De toepassing van.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mede ondersteund door Vanderbilt CTSA subsidie ​​1 UL1 RR024975 van het National Center for Research Resources, National Institutes of Health. Dit werk werd gefinancierd door NIH R01 HL 83839; R01 AI 65.744.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

A. Bereiding van Media

figure-materials-1

B. Bereiding van Tris buffer

  1. Voeg 800 ml van DDH 2 O tot en met 1 L beker.
  2. Maatregel 12 gram Tris en toe te voegen aan de beker.
  3. Voeg 0,12 gram magnesium hexahydraat (MgCl 2: 6H 2 O) in de beker.
  4. Roer met magnetische roerstaaf op de automatische roeren plaat.
  5. Eenmaal opgelost, de pH van de oplossing tot 9,5.
  6. Voeg 200 ml van DDH 2 O in het bekerglas, waardoor het tot 1000mL.
  7. Filtreer de oplossing met een 0,22 urn filter.

C. Materialen nodig voor ELISPOT analyse:

figure-materials-2

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis. Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).
  2. Sung, H. K. E.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ELISPOT AssayT Cell ResponseMicrobial AntigensCytokine DetectionSpot Forming UnitsCapture AntibodyDetection AntibodyPeripheral Blood Mononuclear CellsAlkaline Phosphatase SubstrateDual Color ELISPOT

Gerelateerde artikelen