$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Inductie en monitoring van chronische recidiverende EAE
De emulsie is een 1:1 mengsel van antigeen in waterige oplossing toegevoegd aan aangevuld met Freund's volledig adjuvans. Het is zeer belangrijk om het antigeen toe te voegen aan de hulpstof en niet andersom!
Er is een veel afval bij het maken van en het injecteren van een emulsie. Altijd bereiden 1,5 of 2 keer meer dan wat je nodig hebt.
Gebruik geautoclaveerd mortier, de stamper, glazen spuiten, en bruggen. Alle kunststoffen moet steriel zijn. Het preparaat kan worden gedaan op een regelmatige laboratoriumtafel.
1. Voorbereiding van de aangevuld met adjuvante
Weeg 30 mg van het Mycobacterium tuberculosis (Difco catalogus # 231141) en plaats deze in een vijzel. Maak in dunne poeder zonder op te hard om te voorkomen dat het breken van de bacteriën. Voeg 10 ml van de volledige Freund's adjuvans H37Ra (Difco catalogus # 231131) en meng. Dit aangevuld met adjuvans bevat nu 4 mg / ml Mycobacterium tuberculosis. Transfer naar een buis.
2. Voorbereiding van het ruggenmerg homogenaat
Verzamel ruggenmerg van DA ratten (leeftijd / geslacht onverschillig) en op te slaan ingevroren bij -80 ° C. Weeg de bevroren ruggenmerg te hebben genoeg aan 1:1 (gewicht: volume) mengen met het aangevulde adjuvans. Hak het ruggenmerg zo fijn mogelijk met een scheermesje, over te dragen aan de mortel worden gebruikt in paragraaf 1, en maken een pasta met de stamper.
3. De voorbereiding van de emulsie
- Plaats aangevuld volledig Freund's adjuvans in een buis. Vortex op hoge snelheid. Voeg het ruggenmerg homogenaat druppelsgewijs, terwijl vortexen. Wanneer alle van het ruggenmerg homogenaat wordt toegevoegd, vortex nog 5 minuten. Het mengsel moet draaien licht roze.
- Doe de emulsie in een 5 ml glazen injectiespuit en een link naar een andere 5 ml glazen injectiespuit met behulp van een 18G brug (Fisher catalogus # 14 tot 825-17L). Stuur de emulsie uit een spuit naar de andere totdat het wordt moeilijk (5-10 min). Als er meer dan 5 ml van de emulsie wordt bereid, gebruik maken van verschillende 5 ml spuiten NIET groter spuiten gebruiken.
- De emulsie kan worden opgeslagen in de spuiten bij 4 ° C gedurende 3 weken. Ik raad te bereiden op ten minste 12 uur van tevoren om te controleren dat het niet breken. Het moet blijven dik en niet gescheiden in 2 fasen. De kleur zal 's nachts veranderen in een licht geel of beige.
4. Immunisatie van de ratten
- Meng de emulsie in de spuiten voor een paar minuten en transfer naar de spuit die voor de injectie. Subcutaan injecteren 200 ul aan de basis van de staart met behulp van 23G naalden en 3 ml Luer-Lock spuiten onder de kortlopende anesthesie.
- De ontvangers zijn 7-9 weken oude vrouwelijke DA ratten. We krijgen onze ratten van Harlan Sprague-Dawley.
- Ratten moeten tweemaal per dag worden geobserveerd en gewogen dagelijks. Klinische symptomen worden verwacht 7-15 dagen na de injectie van de emulsie.
Klinische scoren:
0: geen ziekte
0.5: distale slap tail
1: slap tail
2: milde paraparese, ataxie
3: matig paraparese, de ratten trips van tijd tot tijd
3.5: een achterste ledematen is verlamd, de andere zetten
4: complete achterste ledematen verlamming
5: complete achterste ledematen verlamming en incontinentie
6: stervende, ademhalingsproblemen, niet eten of drinken. Euthanaseren onmiddellijk.