Analyse van de pluripotente stamcellen door gebruik te maken van vriescoupes Embryoid Bodies

Summary

Pluripotente stamcellen in suspensie te groeien differentiëren in embryoid organen (EBS). Hier laten we zien hoe een hoge kwaliteit EB vriescoupes handig voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire aspecten van de embryogenese te verkrijgen, met behoud van hun organisatie als aggregaten.

Abstract

Embryonale stamcellen (ES)-cellen zijn pluripotent cellen, afkomstig van de binnenste celmassa van de blastocyst-stadium vroege zoogdieren embryo's ^1. Een cruciale fase in de differentiatie van embryonale stamcellen is de vorming van embryoid organen (EBS) aggregaten ^{2, 3.} EB vorming is gebaseerd op spontane aggregatie bij ES-cellen worden gekweekt in niet-aanhanger platen. Drie-dimensionale EB recapituleert vele aspecten van de vroege zoogdieren embryogenese en differentiëren tot de drie kiembladen: ectoderm, mesoderm en endoderm ^4.

Immunofluorescentie en in situ hybridisatie worden op grote schaal gebruikt technieken voor de detectie van target eiwitten en mRNA in cellen van een weefsel sectie ^{5, 6, 7.} Hier presenteren wij een eenvoudige techniek om een ​​hoge kwaliteit vriescoupes van embryoid lichamen te genereren. Deze aanpak is gebaseerd op de ruimtelijke oriëntatie van de EB inbedding in oktober gevolgd door de cryosection techniek. De resulterende secties kunnen worden onderworpen aan een breed scala aan analytische procedures om populaties van cellen die bepaalde eiwitten, RNA of DNA te karakteriseren. In die zin is de voorbereiding van de EB vriescoupes (10μm) zijn essentiële hulpmiddelen voor histologie vlekken analyse (bijvoorbeeld Hematoxilin en eosine, DAPI), immunofluorescentie (bijv. Oct4, Nestin) of in situ hybridisatie. Deze techniek kan ook helpen om aspecten van de embryogenese met betrekking begrijpen het onderhoud van de driedimensionale bolvormige structuur van de EBS.

Protocol

1. Fixatie en Cryopreservatie

Pluripotente stamcellen werden gekweekt op muis embryonale fibroblasten (MEF) geïnactiveerd met mitomycine C en onderhouden DMEM/F12 aangevuld met 20% knock-out serum vervanging (KSR) en 8ng / mL van fibroblast groeifactor (FGF-2). Met het oog op de vorming EB veroorzaken H9 cellen werden overgebracht naar niet-klevende gerechten en gekweekt gedurende 7 dagen, gehandhaafd in DMEM/F12 aangevuld met 15% KSR ^8.

Let op (!): Deze techniek kan gebruikt worden voor EBS afgeleid is van een embryonaal en geïnduceerde pluripotente stamcellen.

1. Verzamel de EBS uit de cultuur schotel met....

Discussion

De hier beschreven methode biedt een eenvoudig te volgen protocol om PFA vaste dunne cryostaatcoupes van embryoid lichamen nuttig voor immunofluorescentie en in situ hybridisatie assays te verkrijgen. De resulterende vriescoupes toestaan ​​dat de studie van de cellulaire en moleculaire aspecten van menselijke embryonale stamcellen differentiatie, met behoud van hun structuur en organisatie als aggregaten.

....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
D (+) Sucrose	Reagent	Vetec	228
Paraformaldehyde	Reagent	Rieden-de Haën	16005
PBS solution	Reagent	LGC Biotecnology	13-30259.05
Poly-L-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma-Aldrich	P2636	200mg/mL in water
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Reagent	Sakura Finetek	P2636
Sucrose Solution	Reagent			10% Sucrose Solution in PBS w/v
Sucrose Solution	Reagent			20% Sucrose Solution in PBS w/v
Sucrose Solution	Reagent			30% Sucrose Solution in PBS w/v
Conic Tube	Tool	Techno Plastic Products	91015	15mL conic tube
Plate shaker	Tool	Biomixer
Cryostat	Tool	Leica Microsystems	CM 1850
Mold for OCT platform	Tool			Plastic mold plataform