Productie van pseudovirus middels plasmidetransfectie in menselijke cellen

Samenvatting

Bron: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021)

Deze video demonstreert de productie van influenzapsudovirussen in menselijke cellen met behulp van plasmidtransfectie via calciumfosfaat, wat de veilige generatie van single-cycle virusdeeltjes mogelijk maakt voor downstream toepassingen, zoals antilichaamneutralisatie-assays onder biosafety level 2-condities.

Protocol

1. Pseudovirusverpakking met calciumfosfaat-transfectie

1. Maak single-cell suspensies van HEK293FT-cellen (9 x 10⁵ per mL) in compleet DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) medium (Tabel 1). Voeg 10 mL van de single-cell suspensie toe aan een T75-fles en incubeer de cellen in een incubator bij 37 °C en 5% kooldioxide (CO₂) gedurende 20 u vóór de transfectie.
   OPMERKING: HEK293FT met een laag passagegetal (<20 passages) wordt aanbevolen. Zorg ervoor dat de cellaag voor 80-90% confluent is.
2. Vervang het medium 2 u vóór de transfectie door 10 mL vers compleet medium dat chloroquine (100 µM) bevat.<....

Resultaten

Figuur 1: Stroomdiagram van calcium-gemedieerde transfectie. Dit stroomdiagram wordt gebruikt om de belangrijkste procedures van calcium-gemedieerde transfectie te beschrijven.

....

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Calciumchloride anhydrisch	AMRESCO	1B1110-500G	Reagens
Chloroquine-difosfaat	Selleck	S4157	Reagens
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	12100-046	Reagens
Fetaal runderserum	Gibco	16000-044	Reagens
HEK293FT	Gibco	R700-07	Cellijn
HEPES VRIJ ZUUR	AMRESCO	0511-250G	Reagens
HIV-1 p24 antigeen ELISA	ZeptoMetrix	801111	Reagenskit
Luciferase assay system freezer pack	Promega	E4530	Reagenskit
Microcentrifugebuisjes 1,5 mL	Thermo fisher scientific	509-GRD-Q	verbruiksartikel
Nunc conische centrifugebuisjes 15 mL	Thermo fisher scientific	339650	verbruiksartikel
Penicilline-streptomycine	Gibco	15140-122	Reagens
Pipetpunten (10 μL)	Thermo fisher scientific	TF102-10-Q	verbruiksartikel
Pipetpunten (100 μL)	Thermo fisher scientific	TF113-100-Q	verbruiksartikel
Pipetpunten (1000 μL)	Thermo fisher scientific	TF112-1000-Q	verbruiksartikel
Serologische pipetten (5 mL)	Thermo fisher scientific	170355N	verbruiksartikel
Serologische pipetten (10 mL)	Thermo fisher scientific	170356N	verbruiksartikel