Deze video demonstreert de productie van influenzapsudovirussen in menselijke cellen met behulp van plasmidtransfectie via calciumfosfaat, wat de veilige generatie van single-cycle virusdeeltjes mogelijk maakt voor downstream toepassingen, zoals antilichaamneutralisatie-assays onder biosafety level 2-condities.
Methodenartikel
Productie van pseudovirus middels plasmidetransfectie in menselijke cellen
68 weergaven
⸱
31 augustus 2026
In dit artikel
Samenvatting
Protocol
1. Pseudovirusverpakking met calciumfosfaat-transfectie
- Maak single-cell suspensies van HEK293FT-cellen (9 x 105 per mL) in compleet DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) medium (Tabel 1). Voeg 10 mL van de single-cell suspensie toe aan een T75-fles en incubeer de cellen in een incubator bij 37 °C en 5% kooldioxide (CO2) gedurende 20 u vóór de transfectie.
OPMERKING: HEK293FT met een laag passagegetal (<20 passages) wordt aanbevolen. Zorg ervoor dat de cellaag voor 80-90% confluent is. - Vervang het medium 2 u vóór de transfectie door 10 mL vers compleet medium dat chloroquine (100 µM) bevat.
- Meng de reagentia en het plasmide-DNA zoals weergegeven in Tabel 2 en Figuur 1: ddH2O (dubbel gedestilleerd water), pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ8.9, 2,5 M CaCl2 (calciumchloride) en 2x 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonzuur (HEPES) buffer. Pipetteer 5 keer voorzichtig op en neer; incubeer het mengsel bij kamertemperatuur (RT) gedurende 20 min.
- Breng het mengsel over in het medium boven de cellen en schud de fles voorzichtig. Incubeer de cellen in de celincubator gedurende 15 u.
- Vervang het medium door 15 mL vers compleet DMEM-medium. Incubeer de cellen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 65 u.
OPMERKING: De kleur van het medium zal lichtoranje of lichtgeel zijn, en ten minste 80% van de cellen moet het cytopathisch effect (CPE) vertonen onder de omgekeerde lichtmicroscoop. - Oogst het supernatant en centrifugeer dit bij 2095 x g gedurende 20 min bij 4 °C. Verzamel het supernatant, verdeel dit in aliquoten en bewaar deze bij -80 °C.
Tabel 1: Samenstelling van compleet DMEM-medium.
| Samenstelling compleet DMEM-medium | Concentratie |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | 1x |
| Fetaal runderserum | 10% |
| Penicilline(1 U/mL)/Streptomycine | 1 μg/ mL |
Tabel 2: Pseudovirus-verpakkingssysteem.
| Materialen | Concentratie | Volume |
| 2x HEPES (pH 7.1) | -- | 675.0 μL |
| CaCl2 (2.5 M) | -- | 67.5 μL |
| ddH2O | -- | 529.2 μL |
| pCMV Δ 8.9 | 1000 ng/μL | 18.9 μL |
| pCMV/R-HA | 100 ng/μL | 27.0 μL |
| pCMV/R-NA | 50 ng/μL | 13.5 μL |
| pHR-Luc | 1000 ng/μL | 18.9 μL |
Resultaten
Figuur 1: Stroomdiagram van calcium-gemedieerde transfectie. Dit stroomdiagram wordt gebruikt om de belangrijkste procedures van calcium-gemedieerde transfectie te beschrijven.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Calciumchloride anhydrisch | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagens |
| Chloroquine-difosfaat | Selleck | S4157 | Reagens |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagens |
| Fetaal runderserum | Gibco | 16000-044 | Reagens |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cellijn |
| HEPES VRIJ ZUUR | AMRESCO | 0511-250G | Reagens |
| HIV-1 p24 antigeen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagenskit |
| Luciferase assay system freezer pack | Promega | E4530 | Reagenskit |
| Microcentrifugebuisjes 1,5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | verbruiksartikel |
| Nunc conische centrifugebuisjes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | verbruiksartikel |
| Penicilline-streptomycine | Gibco | 15140-122 | Reagens |
| Pipetpunten (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | verbruiksartikel |
| Pipetpunten (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | verbruiksartikel |
| Pipetpunten (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | verbruiksartikel |
| Serologische pipetten (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | verbruiksartikel |
| Serologische pipetten (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | verbruiksartikel |
