MicroRNA-silencing op basis van Potato Virus X in aardappelplanten

In dit artikel

Samenvatting

Bron: Zhao, J., et al. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato. J. Vis. Exp. (2020).

Deze video demonstreert het gebruik van Agrobacterium tumefaciens voor het afleveren van een construct op basis van Potato Virus X (PVX) in in vitro gekweekte aardappelplanten voor virus-gebaseerde microRNA-silencing (VbMS). Deze methode maakt systemische onderdrukking van een doelwit-microRNA mogelijk, waardoor onderzoekers de rol ervan in de plantontwikkeling kunnen bestuderen via observeerbare fenotypische veranderingen.

Protocol

1. Voer de PVX-gebaseerde VbMS-assay uit in aardappelplanten.

Transplante 4 weken oude in vitro aardappelplanten in de bodem. De getransplanteerde planten worden 3–4 dagen later onderworpen aan de VbMS-assay.
Inoculeer aardappelplanten met Agrobacterium dat de PVX-STTM (Short Tandem Target Mimic) plasmiden bevat.
OPMERKING: Voor de VbMS-assay in aardappel worden Agrobacterium-gemedieerde infiltratie en inoculatie door krassen met een tandenstoker gelijktijdig uitgevoerd.
1. Selecteer en inoculeer positieve transformanten die PVX-STTM vectoren bevatten in 50 mL vloeibaar LB met 50 μg/mL kanamycin en 50 μg/mL rifampicine. Kweek in een incubator bij 28 °C op 20 rpm gedurende 16 u tot OD₆₀ = 1.0.
2. Strijk gelijktijdig de positieve Agrobacterium-kolonies uit op ten minste twee nieuwe LB-platen met 50 μg/mL kanamycin en 50 μg/mL rifampicine en kweek bij 28 °C gedurende 1 dag. Voeg de PVX-LIC vector toe als controle en PVX-GFP om de verspreiding van het virus te monitoren.
3. Oogst de vloeibare Agrobacterium-cultuur door centrifugatie bij 3.40 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Resuspendeer Agrobacterium-cellen in een gelijk volume infiltratiebuffer (10 mM MgCl₂, 10 mM MES en 20 µM acetosyringon, pH = 5,6) en stel in op OD₆₀ = 1.0. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 6 u.
4. Infiltreer de Agrobacterium-cultuur in de abaxiale zijde van volledig uitgegroeide bladeren met een naaldloze spuit van 1 mL.
  1. Klap een blad om en houd dit met één hand vast, gebruik vervolgens één vinger om de bladschijf vanaf de adaxiale zijde bij de infiltratieplaats te ondersteunen. Houd de spuit met de andere hand verticaal op het bladoppervlak en infiltreer de Agrobacterium-cultuur in de abaxiale zijde van de bladschijf.
5. Schraap de Agrobacterium-cultuur van de LB-platen en kras met een tandenstoker het stengoppervlak van de eerste één of twee internodiën van de geïnfiltreerde aardappelplanten. Kras voorzichtig over de epidermis van de stengel. Vermijd het doorboren van de stengel, aangezien dit ernstige schade aan de planten kan veroorzaken.
Kweek de geïnfiltreerde planten bij 2 °C met een fotoperiode van 16 u licht/8 u donker en een lichtintensiteit van 120 μmol/m²∙ s¹ in een kas.
OPMERKING: Fenotypes veroorzaakt door miRNA-silencing verschijnen gewoonlijk 2–4 weken na inoculatie (Figuur 1, Figuur 2). Meestal duurt het 10–20 dagen voordat het VbMS-fenotype na infiltratie verschijnt. Het VbMS-fenotype is afhankelijk van de eigenschappen van het specifieke miRNA en de doelgenen, de groeiomstandigheden en de aardappelvariëteiten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1: VbMS van miR165/166 in de tetraploïde aardappelvariëteit Katahdin. Fenotypes van de aardappelplanten (Katahdin) die de PVX-vectorcontrole of PVX-STTM165/16 tot expressie brengen. Magenta pijlen duiden ectopisch gevormde bladstruct...