Deze video demonstreert de stapsgewijze procedure voor het bereiden van cryosneden van de muizenretina om de permeabiliteit van adeno-geassocieerde virussen door verstoorde retinale barrières te visualiseren.
Methodenartikel
Bereiding van cryosneden van de muisretina om de permeabiliteit van de retina voor adeno-geassocieerde virussen te beoordelen
62 weergaven
⸱
31 augustus 2026
In dit artikel
Samenvatting
Protocol
Alle procedures met dierlijke monsters zijn beoordeeld en goedgekeurd door de betreffende ethische commissie voor dierproeven.
- Voor retinaal cryosecties (Figuur 1), dissecteer geënucleerde ogen om de lens en het hoornvlies te verwijderen, en fixeer deze door immersie in 4% paraformaldehyde gedurende 1 u.
- Cryoprotegeer de eerder gefixeerde ogen in 10% sucrose gedurende 1 u bij kamertemperatuur, en in 20% sucrose gedurende nog een uur bij kamertemperatuur. Cryoprotegeer in een 30% sucrose-oplossing, overnacht bij 4 °C. Bevries en bedrijf de oogbekers in een inbedhars zoals Cryo-matrix. Maak cryosecties van 10 µm en monteer deze op objectglazen die speciaal zijn behandeld voor bevroren weefselcoupes en die de weefseladhesie tijdens de kleuring verbeteren.
- Permeabiliseer de coupes met 0,1% Triton X-100 in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 gedurende 5 min. Was 2x met PBS en blokkeer gedurende 1 u bij kamertemperatuur in PBS met 1% runder-serumalbumine (BSA) en 0,1% Tween 20.
Resultaten
Figuur 1: Schematische weergave van het algemene protocol. Na de productie van adeno-geassocieerd virus (AAV) worden de deeltjes geïnjecteerd in het glasvocht of in de penisader bij gebouteerde volwassen muizen. Fundusbeelden worden gemaakt met een Micron III camera om de expressie van het groen fluorescerende eiwit (GFP) te volgen. Het GFP-expressiepatroon wordt geanalyseerd op retina-cryosecties en flatmounted retina's middels immunohistochemie en confocale beelden. De passage van het AAV door de bloed-retina-barrière (BRB) wordt beoordeeld via polymerasekettingreactie (PCR)-analyse op bloedmonsters van intravitreaal of intraperitoneaal geïnjecteerde muizen, om de aanwezigheid van de GFP-sequentie te detecteren, wat een indicator is voor de aanwezigheid van AAV-deeltjes in de bloedbaan.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost plus adhesion slides | Thermo Scientific | 10143352 | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs met epi- en dia-standaard / Dissectie van retina's |
| Spring scissors straight - 8.5 cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinale dissectie |
