Deze video demonstreert de methode voor AAV-gemedieerde genoverdracht in een retina van een transgene muis, gevolgd door dissectie en kleuring van het weefsel om de integriteit van het intern begrenzend membraan te beoordelen.
Methodenartikel
AAV-gemedieerde genoverdracht voor visualisatie van aangetaste integriteit van het netvliesmembraan
10 weergaven
⸱
31 augustus 2026
In dit artikel
Samenvatting
Protocol
Alle procedures met dierlijke monsters zijn beoordeeld en goedgekeurd door de toepasselijke ethische commissie voor dierproeven.
1. Immunohistochemie
- Voor retina-flatmounts (Figuur 1), fixeer geënucleerde ogen in 4% paraformaldehyde gedurende 15 min om de dissectie te vergemakkelijken.
- Dissekeer de ogen binnen 15-30 min om het hoornvlies en de lens te verwijderen. Scheid de retina van het retinaal pigmentepitheel (RPE) en de sclera door rond de ora serrata en de oogzenuw te snijden. Dompel gedurende nog eens 30 min onder in 4% paraformaldehyde om de retina en het fluorescerende eiwit in getransduceerde retina-cellen te fixeren (de fixatie mag 24 uur niet overschrijden). Was 5 min in steriele PBS, pH 7,4.
- Vervang de fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door blokkeringsbuffer (PBS met 1% runder-serumalbumine (BSA), 2% normaal geiten- of ezelserum, 0,5% Triton X-10) en incubeer in blokkeringsbuffer gedurende 4 uur bij kamertemperatuur of overnight bij 4 °C.
- Incubeer weefsels met primaire antilichamen in een blokkeringsbuffer gedurende 4 uur bij kamertemperatuur of overnight bij 4 °C. Was 3x met PBS.
OPMERKING: De gebruikte antilichamen zijn als volgt: anti-laminine (1/1.0) voor het labelen van de ILM (inner limiting membranes), anti-rhodopsine kloon 4D2 (1/50) voor het labelen van staafjes, anti-glutaminesynthetase kloon GS-6 (1/1.50) voor het labelen van Müller-cellen, Peanut agglutinin (PNA) lectine (1/40) voor het labelen van kegeltjes. - Incubeer weefsels met een 1:50 verdunning van alexa fluor-geconjugeerde secundaire antilichamen in blokkeringsbuffer gedurende 1 uur (cryosecties) of 2 uur (flatmounts) bij kamertemperatuur en beschermd tegen licht. Was 3x met PBS.
- Maak ontlastingssneden in de retina en monteer deze plat (flat-mount) op een glazen objectglas, waarbij ofwel de fotoreceptorzijde of de zijde van de retina-ganglioncellen (RGC) naar boven is gericht. Voeg een waterig monteermedium toe, breng een dekglas aan en bewaar bij 4 °C.
- Voer confocale microscopie uit op een laser-scanning confocale microscoop. Verwerf beelden sequentieel, lijn voor lijn, om crosstalk tussen excitatie en emissie te verminderen. Bepaal de stapgrootte volgens het Nyquist-Shannon-steekproefstelling. Gebruik belastingsinstellingen die oververzadigde pixels in de uiteindelijke beelden minimaliseren. Verwerk 12-bit beelden met FIJI, projecteer Z-secties op een enkel vlak met behulp van maximale intensiteit onder de Z-project functie, en converteer tot slot naar de 8-bit RGB-kleurmodus.
Resultaten
Figuur 1: Schematische weergave van het algemene protocol. Na AAV-productie worden de particles geïnjecteerd in het glaslichaam of in de penisader bij genetumeerde volwassen muizen. Er worden fundusbeelden gemaakt met een Micron III-camera om de GFP-expressie (Green fluorescent protein) te volgen. Het GFP-expressiepatroon wordt geanalyseerd op retinale cryosneden en flat-mounted retina's middels immunohistochemie en confocale beelden. De passage van AAV door de BRB wordt beoordeeld via PCR-analyse van bloedmonsters van intravitreale of intrapenale geïnjecteerde muizen, om de aanwezigheid van de GFP-sequentie te detecteren, een indicator voor de aanwezigheid van AAV-particles in de bloedbaan.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 1014352 | Objectglazen |
| Anti-laminine | Sigma | L9393 | Antilichaam |
| Anti-rhodopsine kloon 4D2 | Millipore | MABN15 | Antilichaam |
| Anti-glutaminesynthetase kloon GS-6 | Millipore | MAB302 | Antilichaam |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | Antilichaam |
| PNA Lectine | Invitrogen | L32459 | Sonde |
| Alexa fluor-geconjugeerde secundaire antilichamen | Invitrogen | Antilichaam | |
| Fluorsave-reagens | Calbiochem | 345789 | Inmontagemedium |
| Evans Blue-kleurstof | Sigma | E2129 | Kleurstof |
| Formamide spectrophotometrisch | Sigma | 295876-2L | |
| Fluoresceïne | Sigma | F2456 | Kleurstof |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscoopsysteem op basis van 3-CCD kleurencamera, frame grabber en standaardsoftware waarmee onderzoekers muisretina's kunnen afbeelden. | |
| Binoculaire vergrootglas SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0,6 x 5 x LED's met epi- en dia-standaard / Dissectie van retina's |
| Veerschaar recht - 8,5 cm | Bionic France S.a.r.l | 1503-08 | Retinale dissectie |
