Visualisatie van hittebehandelde virale capsiden met transmissie-elektronenmicroscopie

Samenvatting

Bron: Moore, M. D., et al. Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity. J. Vis. Exp.(2017).

Deze video demonstreert hoe gezuiverde virale capsiden worden hittebehandeld, geprepareerd en afgebeeld met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) om structurele veranderingen en door hitte veroorzaakte schade bloot te leggen.

Protocol

1. Voorbereiding van TEM-monsters
   1. Verkrijg grids met een koolstofsupportfilm (nikkel) die ontworpen zijn voor TEM.
      OPMERKING: Raadpleeg de core facility over de aanbevolen reagentia en de hantering hiervan voor gebruik met de microscoop van de faciliteit. Bewaar de grids in een doos met droogmiddel of in een vacuümkamer om blootstelling aan vocht te minimaliseren.
   2. Scheur stukjes filterpapier van ongeveer 5 cm x 5 cm af. Gebruik glazen Petrischalen en geschikte zelfsluitende reverse pincetten die zijn ontworpen voor gebruik in de microscopie.
   3. Snijd een stuk paraffinefolie van ongeveer 2,5 cm x 5 cm af. Plaats dit op de werkbank.
   4. Hittebehandeling van norovirus GII.4 Sydney-capsiden
      1. Verkrijg gezuiverd menselijk norovirus major capsid protein (VP1) van GII.4 Sydney (Accession: JX459908) geassembleerd in capsiden. 
         OPMERKING: De capsiden in deze studie werden vriendelijk ter beschikking gesteld door R. Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX).
      2. Verdun de capsiden in 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonzuur (HEPES) (pH 7,4) tot een maximumvolume van 15 µL in individuele afgesloten polymerasekettereactie (PCR)-buisjes. Zorg ervoor dat het buisje ten minste 600 ng capsid bevat. Zorg dat er 600 ng capsid per behandeling-ligandcombinatie aanwezig is.
      3. Verwarm de thermische cycler voor tot de gewenste hittebehandeling. 
         OPMERKING: Voor dit protocol is een behandeling bij 68 °C gedurende verschillende tijden (0 - 25 min) gekozen.
      4. Verwarm een extra thermische cycler voor tot 4 °C voor onmiddellijke koeling. Plaats de buisjes met capsid-oplossing in de thermische cycler voor de gewenste tijd. Breng ze na verhitting onmiddellijk over naar een vooraf gekoelde cycler van 4 °C voor 5 min.
      5. Centrifugeer kort om alle druppels naar de bodem van het buisje te brengen.
      6. Pipetteer de volledige druppel van ~15 µL behandelde capsid-oplossing op de paraffinefolie.
   5. Pak de rand van de grid vast met de pincet, zodat deze op de rand sluit om de grid vast te houden, en plaats de grid met de koolstofzijde naar beneden bovenop de druppel van de behandelde oplossing. Laat dit 10 min incuberen zodat het capsid aan de grid kan hechten.
      1. Afhankelijk van de zuiverheid van de capsid-preparatie kunnen, indien nodig, wasstappen met de 10 mM HEPES-oplossing worden toegevoegd in de vorm van druppels van 10-15 µL die in lijn achter de druppel behandelde capsid worden geplaatst.
      2. Pak na 10 min de grid met de druppel op. Plaats de grid bijna loodrecht tegen een stuk filterpapier om de druppel weg te zuigen. Neem de druppel van 10 - 15 µL HEPES-buffer op met de grid, houd dit 30 s vast en zuig deze vervolgens weg met een ander stuk filterpapier om te wassen.
   6. Plaats een druppel van 15 µL 2% uranylacetaat-oplossing op de paraffinefolie in een leeg gebied.
      1. Neem de druppel uranylacetaat op met de grid en houd dit 45 s vast. Zuig het uranylacetaat weg, waarbij u ervoor zorgt dat het grootste deel van de oplossing wordt verwijderd. Plaats de grid met de koolstofzijde naar boven op een stuk filterpapier; let erop dat de grid niet "plakt" aan het vocht op de pincet. Plaats het filterpapier met de grid in een open glazen Petrischaal.
         OPMERKING: Gebruik geen plastic Petrischalen, omdat de grids daar elektrostatisch aan worden aangetrokken en aan de schaal blijven plakken.
   7. Herhaal dit voor alle behandelingen. Plaats de helften van de Petrischaal met de grids overnacht in een desiccator om te drogen voordat ze met TEM worden geobserveerd.
   8. Raadpleeg de microscopie-faciliteit van de betreffende instelling over het observeren van de geprepareerde grids. Sommige faciliteiten staan toe dat de gebruiker wordt opgeleid in de bediening van het instrument van hun faciliteit. Specifieke details over de instelling en observatie van een specifieke microscoop vallen buiten het bereik van dit artikel.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie
Nikkel-elektronenmicroscopierosters met koolstofsupportfilm	Ladd Research	10880-100
Zelfsluitende reverse pincetten voor elektronenmicroscopie	Ted Pella	5372-NM
Kwalitatief filterpapier	Sigma-Aldrich (Whatman)	WHA1002055
Glazen petrischalen	Sigma-Aldrich	BR455743
100 mM HEPES-stoomoplossing (pH 7,2)	N/A	N/A
2% uranylacetaat	N/A	N/A