Bacteriofaag-gemedieerde genoverdracht in spirocheet-bacteriën

Samenvatting

Bron: Eggers, C. H. Fage-gemedieerde genetische manipulatie van de ziekte van Lyme spirochaet Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (202). Deze video demonstreert de transductie van genetisch gemodificeerde Borrelia-spirocheten met behulp van niet-infectieuze bacteriofagen, geprecipiteerd met polyethyleenglycol, die een kanamycin-resistentieplasmid dragen. Na incubatie met de bacteriën wordt de cultuur geplaatst op medium aangevuld met antibiotica. Alleen cellen die het plasmid ontvangen, overleven en vormen kolonies. Deze kolonies worden vervolgens geselecteerd en uitgebreid in een vloeibaar medium met antibiotica om een stabiele, plasmid-dragende bacteriële populatie vast te stellen voor downstream-applicaties. Eggers, C. H. Faag-gemedieerde genetische manipulatie van de ziekte van Lyme-spirocheet Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp.. (2022).

Deze video demonstreert de transductie van genetisch gemodificeerde Borrelia-spirocheten met behulp van met polyethyleenglycol geprecipiteerde, niet-infectieuze bacteriofagen die een kanamycin-resistentieplasmid dragen. Na incubatie met de bacteriën wordt de cultuur uitgeplaat op medium aangevuld met antibiotica. Alleen cellen die het plasmid ontvangen, overleven en vormen kolonies. Deze kolonies worden vervolgens geselecteerd en uitgebreid in een vloeibaar medium met antibiotica om een stabiele, plasmid-dragende bacteriële populatie vast te stellen voor verdere toepassingen

Protocol

1. Transductie-assay na PEG (polyethyleenglycol) precipitatie van bacteriofaag φBB-1

1. Bereid B. burgdorferi-culturen voor om als recipiënt in transductie-assays te worden gebruikt. Bereken op basis van de bepaalde dichtheid het benodigde cultuurvolume van de recipiënt om 15 mL van 1 × 107 spirochetes·mL−1 te verkrijgen.
2. Centrifugeer het cultuurvolume bij 6.0 x g gedurende 10 min. Giet het supernatant af en resuspendeer de pellet in 14,5 mL vers BSK (Barbour-Stoenner-Kelly).
3. Voeg ≤50 µL van het met PEG geprecipiteerde fage-monster toe aan de cultuur van de recipiënte kloon. Meng goed en incubeer bij 3 °C gedurende 72-96 h.
   OPMERKING: De hoeveelheid fagen die tijdens de PEG-precipitatie wordt teruggewonnen, kan variëren afhankelijk van een aantal factoren. Echter, uit een cultuur van 15 mL van de geïnduceerde B. burgdorferi-stam CA-1.2A bevat 50 µL doorgaans 50-1.0 levensvatbare fagen28. Terugwinningsvolumes van fagen ≥50 µL hebben een nadelig effect op de groei van B. burgdorferi, waarschijnlijk door de verhoogde ratio SM (Suspension Medium) ten opzichte van BSK.
4. Voer de selectie van transductanten uit door uitplating op vaste fase na menging met de met PEG geprecipiteerde fagen.

2. Selectie van transductanten

OPMERKING: Het uitplaten op vaste fase van potentiële transductanten wordt uitgevoerd met een aanpassing van het protocol via een enkellaags proces. B. burgdorferi kolonies groeien binnen de agar, dus voor de selectie van transductanten door uitplaten op vaste fase moeten de monsters aan de media worden toegevoegd terwijl de platen worden gegoten. Deze techniek zou mogelijk ook effectief kunnen zijn voor de selectie van transductanten, maar is voor dit doel nog niet beproefd.

1. Bepaal het aantal platen dat nodig is voor de selectie van transductanten op basis van het aantal monsters uit de transductie-assays en controles dat moet worden geplaatst.
   OPMERKING: Gewoonlijk worden er twee platen gegoten per monster: één die gelijkstaat aan ongeveer 10% van het cultuurvolume en één die de rest van de cultuur bevat. Giet daarnaast platen die dienen als negatieve controles om afzonderlijk te testen of de fagenpreparatie en/of de ouderclonen die als donor en recipient zijn gebruikt niet groeien in de aanwezigheid van het antibioticum of de antibiotica die tijdens de selectie worden gebruikt. Het wordt ook aanbevolen om platingmateriaal voor ten minste twee extra platen voor te bereiden. Als het aantal monsters en controles dat geplaatst moet worden bijvoorbeeld acht is, bereid dan voldoende platingmengsel voor 10 platen.
2. Bereid de oplossingen voor het uitplaten voor zoals hieronder beschreven.
   OPMERKING: Elke plaat zal 30 mL bevatten, bestaande uit 20 mL 1,5x BSK voor het uitplaten en 10 mL 2,1% agarose (verhouding 2:1). Dit resulteert in een plaat met uiteindelijke concentraties van 1x BSK en 0,7% agarose. Bereid bijvoorbeeld voor 10 platen een totale uitplaatmix van 30 mL, bestaande uit 20 mL 1,5x BSK en 100 mL 2,1% agarose.
   1. Bereid 1 L 1,5x BSK voor met de hoeveelheden van elk component zoals vermeld voor 1,5x BSK. Bewaren zoals beschreven voor 1x BSK.
   2. Bereid 2,1% agarose in water en autoclaveer dit. Gebruik de agarose-oplossing vers of bewaar deze bij kamertemperatuur. Indien bewaard bij kamertemperatuur, verhit de oplossing in de magnetron met het deksel losjes gesloten tot deze volledig gesmolten is voordat u de platen giet.
   3. Bepaal het volume antibioticum dat nodig is om de juiste concentratie te bereiken op basis van het totale volume van het mengsel voor het uitplaten.
      OPMERKING: Als het totale volume van de uiteindelijke uitplaatoplossing 30 mL is, meng dan 20 mL 1,5x BSK met voldoende antibioticum om te waarborgen dat de volledige 30 mL de juiste uiteindelijke antibioticumconcentratie heeft. Als zowel de donor als de recipient in de transductie-assay verschillende antibioticumresistentiegenen hebben, moet het uitplaatmengsel beide antibiotica bevatten. Als de met PEG geprecipiteerde faag van de donor een antibioticumresistentiemarker codeert en de recipient geen heeft, moet het uitplaatmengsel slechts één antibioticum bevatten.
3. Breng, op basis van het aantal te gieten platen, de juiste hoeveelheid 1,5x BSK en antibioticum(s) over naar een steriele fles die groot genoeg is om het volledige mengsel voor de platen te bevatten. Equilibreer in een waterbad bij 56 °C gedurende ≥15 min.
4. Laat gesmolten agarose uit de autoclaaf of magnetron equilibreren in een 56 °C waterbad gedurende ≥15 min.
5. Na equilibratie wordt de bepaalde hoeveelheid 2,1% agarose toegevoegd aan de fles met 1,5x BSK (met antibioticum) en wordt de plaatoplossing teruggeplaatst in het waterbad bij 42 °C gedurende 10-15 min.
   OPMERKING: Hogere temperaturen kunnen de spirocheten beschadigen of doden36. Indien hetzelfde waterbad als hierboven wordt gebruikt, koel het waterbad dan af tot 42-45 °C voordat de timer voor de equilibratie wordt gestart. Laat de plating-oplossing niet equilibreren bij 42 °C langer dan 20 min, anders begint het te stollen tijdens het gieten van de platen.
6. Tijdens de equilibratie bereidt u de B. burgdorferi monsters die geplaatst moeten worden. Breng de hoeveelheid die geplaatst moet worden over in een steriele conische centrifugebuis van 50 mL
7. Indien er een hoeveelheid van minder dan 1,5 mL wordt uitgeplaat ($\text{}$<(5% van het uiteindelijke plaatvolume van 30 mL), breng het monster over naar de nieuwe buis en voeg de platingmix direct aan het monster toe tijdens het uitplaten.
   1. Voor grotere volumes brengt u het gewenste volume cultuur over naar de nieuwe buis en centrifugeert u dit vervolgens gedurende 10 min bij 6.0 x g bij kamertemperatuur. Giet alles weg, behalve 10-500 µL van het supernatant en gebruik de rest om het pellet volledig te resuspenderen vóór het uitplaten.
   2. Voor controleplaten na co-cultuur voegt u ≥10⁷ cellen van de donor- of recipiëntklonen toe aan steriele conische centrifugebuisjes van 50 mL. Als het volume groter is dan 1,5 mL, centrifugeert u de suspensie en resuspendeert u het pellet. Als er een transductie-assay is uitgevoerd met de PEG-geprecipiteerde faag, voegt u dan, naast de recipïëntkloon, 10-250 µL van het faagmonster in een steriele conische buis van 50 mL voor uitplaten.
8. Nadat de plaatoplossing is geëquilibreerd bij 42-45 °C gedurende 10-15 min, breng 30 mL van de plating-oplossing over in een buis met het betreffende monster; verdeel het plating-mengsel en het monster onmiddellijk over een gelabelde plaat. Herhaal dit met een schone pipet voor elk monster dat geplaatst moet worden.
9. Laat de platen 15-20 min uitharden en plaats ze vervolgens in een 33 °C incubator aangevuld met 5% CO2₂Keer de platen gedurende ten minste 48 uur na het gieten niet om.
10. Afhankelijk van de achtergrond van de ontvangende kloon moet worden gecontroleerd of de kolonies na 10 tot 21 dagen incubatie in de agarose op de selectieplaten verschijnen. Selecteer ten minste 5 tot 10 kolonies die op de plaat groeien in aanwezigheid van beide antibiotica met behulp van een gesteriliseerde borosilicaatpipet van 5,75 inch met een katoenprop en inoculeer deze in 1,5 mL 1x BSK met de betreffende antibioticum(s).
11. Kweek de geinoculeerde kolonies bij 33 °C gedurende 3-5 dagen of totdat ze een dichtheid bereiken van ongeveer 20-40 spirocheten per veld bij een 20x vergroting met donkerveldmicroscopie.
    OPMERKING: Zodra ze zijn gescreend, kunnen de spirocheten worden ingevroren voor langdurige bewaring bij −80 °C door een gelijk volume kweek te mengen met een mengsel van 60% glycerol en 40% 1x BSK, gesteriliseerd door filtratie door een 0.22 µm filter.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
15 mL conische centrifugebuizen (polypropyleen)	USA Scientific	5618-8271
Mitomycine C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	WAARSCHUWING: potentieel carcinogeen; uitsluitend gebruiken in een chemische zuigkast
5,75 Pasteur-pipetten (met katoenprop/borosilicaatglas/niet-steriel)	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	Voor gebruik autoclaveren
50 mL conische centrifugebuizen (polypropyleen)	USA Scientific	150-1211
Absolute ethanol
Erytromycine	Research Products International Corp	E5700-25.0
Gentamicine-reagensoplossing	Gibco	15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous)	Thermo Fisher Scientific	BP350-50
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-50
Kanamycinesulfaat	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0