<ol style="margin-top: 0in"><li> Knip de staart stukken (3mm) en Mark oren. </li><li> Voeg 720 m l STE en 30 m l proteïnase K (10 mg / ml bouillon). </li><li> Incubeer bij 55 ° C bij verhitting blok en vortex elk uur gedurende 3 uur bij topsnelheid voor 10 seconden. </li><li> Inactiveren proteïnase K bij 70 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Quench op ijs gedurende 5 minuten. </li><li> Centrifuge tail DNA gedurende 10 minuten op volle snelheid. </li><li> Giet in nieuwe buis die 720 m l isopropanol. &nbsp; </li><li> Neerslag DNA door het omkeren van de buis of vortexen. </li><li> Spin down DNA gedurende 5 minuten op volle snelheid. Verwijder supernatant. </li><li> Was de pellet met 70% ethanol. </li><li> Spin down genomisch DNA 5 minuten op volle snelheid. Verwijder supernatant. </li><li> Laat DNA drogen 1-2 minuten. </li><li> Resuspendeer DNA in 100-200 m l afhankelijk van de grootte van de pellet. </li><li> Plaats buis bij 55 ° C gedurende 1 uur tot ontbinding van DNA te vergemakkelijken. &nbsp; </li></ol>

<table><tbody><tr><td>STE</td><td>Bufferoplossing</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris; pH 8,5 / 5 mM EDTA / 0,2% SDS / 200 mM NaCl / in H2O</td></tr><tr><td>TE</td><td>Buffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris; pH 5,0 / 1 mM EDTA / 10 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

isolatie van genomic dna van muis tails

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolatie van Genomic DNA van muis Tails

Dit is een 10 dagen oude muizenpup en ik ga een staartbiopsie uitvoeren om vervolgens genomisch DNA uit de staart te extraheren. Ik knip een klein stukje van de staart af, ongeveer drie millimeter, en plaats dit stukje staart in een Eppendorf-buisje, dat ik vervolgens op droge ijs plaats. Om contaminatie tussen de muizen te voorkomen, markeer ik gewoonlijk het scheermesje op de plek waar ik de laatste snede heb gemaakt.Op die manier zal ik voor de volgende muis zeker een schoon stukje scheermes gebruiken voor het nemen van de volgende staartbiopsie. Om onderscheid te maken tussen de verschillende muizen in uw nest, heeft u een manier nodig om de muizen te identificeren. Een manier om dit te doen is door een gaatje in hun oren te ponsen met een oorpons, zoals hier getoond.Pak de muis voorzichtig bij de nekvel, draai hem om en klem de staart tussen uw vingers. Neem de oorpuncher in de andere hand en maak een snelle inkeping in het oor van de muis. Ziet u hoe pijnloos dat was?Oké, nu ziet u dat ik enkele stukjes staart in deze Eppendorf-buisjes heb en nu ga ik de oplossingen toevoegen die helpen bij de digestie. Eerst voeg ik 720 µL STE-oplossing toe, en daarna voeg ik 30 µL Proteinase K toe. Hier ziet u het stukje staart dat we vóór de digestie hebben afgesneden.Ik plaats nu de staartstukken op een verwarmingsblok van 55 °C. Veel protocollen schrijven een continue schommelbeweging voor bij 55 °C, maar voor mijn doeleinden is dit niet nodig omdat ik de staartstukken zal vortexen. Ik vortex nu het stukje staart gedurende twee seconden.Eén, twee. Na het vortexen is hier een blik op wat er nu in de Eppendorf-buis over is gebleven, en u kunt zien dat het stukje staart volledig is opgelost; activeer vervolgens de proteinase K bij 70 °C gedurende vijf minuten. Stop de reactie op ijs gedurende vijf minuten.Centrifugeer de staartstukken 10 minuten op volle snelheid in een microcentrifuge. In deze microcentrifuge is de volle snelheid 13.000 RPM. Terwijl de spijsverteringsstaarten worden gecentrifugeerd, labelt u enkele Eppendorf-buisjes en vult u deze met 750 µL isopropanol.Nadat de verteerde staarten zijn gecentrifugeerd, vormen het haar en het onverteerde materiaal een pellet onderin de buis; schenk de vloeistof af. De oplossing die het verteerde materiaal, STE en proteinase K bevat, wordt overgebracht naar de Eppendorf-buis met isopropanol. Het DNA zal uit de oplossing beginnen te treden en zal er spookachtig en veerachtig uitzien; die bubbel die daar rondzwemt, is het genomisch DNA dat uit de staart van de muis is geïsoleerd. Na het mengen van de isopropanol en de STE-oplossing zal het genomisch DNA neerslaan en verschijnen als dit kleine bolletje; centrifugeer het geprecipiteerde genomische DNA vijf minuten op maximale snelheid in een microcentrifuge.Onderaan de buis is ons gepellete genomische DNA te zien. Nu zal ik de oplossing in de buis aspireren, waarbij alleen het pellet van genomisch DNA achterblijft. Elke keer dat ik een andere buis aspireer, vervang ik de pipetpunt.Plaats de punt van deze aspirator op de pellet. Na het wegzuigen van de STE en isopropanol voeg ik één milliliter 70% ethanol toe om de genomische DNA-pellet te wassen. Omdat de pellet van genomisch DNA meestal aan de wand van een microcentrifugebuisje kleeft en moeilijk los te krijgen is om deze grondig te wassen in de 70% ethanol, moet u deze over het rek voor microcentrifugebuisjes schrapen dat ik hier heb.Dat kan op deze manier worden gedaan. Hier ziet u het genomisch DNA nadat het is neergeslagen en gewassen in 70% ethanol. Ik ga dit opnieuw centrifugeren op maximale snelheid gedurende vijf minuten en vervolgens de 70% ethanol wegzuigen om de pellets van genomisch DNA na het wassen neer te slaan.Centrifuge ze met 70% ethanol gedurende vijf minuten op maximale snelheid, aspireer vervolgens de 70% ethanol en laat het DNA vijf minuten drogen. Hier is het pellet genomisch DNA onderin de buis, en dit is ongeveer zo droog als het moet zijn. Ik heb de pellets genomisch DNA uit de muizenstaarten nu gedroogd en ik ga nu 100 µL 40 mM tris bij pH 8 toevoegen.Ik heb het genomisch DNA bij 50 °C staan, waardoor het sneller in oplossing gaat dan bij kamertemperatuur. Na ongeveer een uur bij 50 °C vries ik het in of bewaar ik het bij 4 °C tot ik mijn PCR-reacties wil uitvoeren om vast te stellen welke muizen positief zijn voor mijn transgen.

Isolatie van Genomic DNA van muis Tails

In dit artikel

Protocol

Materialen

Herprints en machtigingen

Tags

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
STE	Bufferoplossing			100 mM Tris; pH 8,5 / 5 mM EDTA / 0,2% SDS / 200 mM NaCl / in H2O
TE	Buffer			100 mM Tris; pH 5,0 / 1 mM EDTA / 10 mM NaCl