Genoverdracht naar intestinale organoïden van muizen met behulp van lentivirale vectoren

Samenvatting

Bron: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015)

Deze video beschrijft de lentivirale transductie van muis-intestinale organoïden vanuit een suspensie die crypt-achtige structuren bevat. Met behulp van een basaalmembraanmatrix als steunstructuur en medium aangevuld met groeifactoren worden lentivirale vectoren geïntroduceerd om stabiele genintegratie mogelijk te maken

Protocol

Lentivirale Transductie van Organoïden

Dag 0:

1. Splits twee dagen voor de transductie een volle well van 0,95 cm² met organoïden in een nieuwe well, met als doel ongeveer 50 kleine organoïden te verkrijgen. Splits de organoïden (Figuur 1A, B).
2. Voeg 10 µM Chir99021 en 10 mM nicotinamide toe aan het kweekmedium voor organoïden om cystische hyperproliferatieve crypten te verkrijgen (Figuur 1C).
   OPMERKING: Cystische crypten ontwikkelen zich het best wanneer vers gesplitste organoïden worden gekweekt in aanwezigheid van Chir99021.

Dag 2:

3. Oogst de organoïden door het matrigel en medium herhaaldelijk met een p1000 micropipet op en neer te pipetteren, waardoor het mengsel wordt gedisrugeerd. Plaats het mengsel in een 15 mL buis.
4. Disrugeer verder met een Pasteur-pipet waarvan de distale opening door verhitting is verkleind. Centrifugeer de organoïden 5 min bij 100 x g om een pellet te vormen.
   OPMERKING: Afhankelijk van de grootte van de centrifuge moet een andere centrifugesnelheid worden gebruikt. Het is noodzakelijk om de exacte snelheid te bepalen waarbij de gedisrugeerde organoïden van het mengsel worden gescheiden.
5. Verwijder het supernatant en voeg 500 µL voorverwarmde 1x trypsine (vergelijkbaar met 0,25% trypsine) toe. Resuspendeer de organoïden in trypsine en incubeer deze 3 min in een waterbad van 37 °C.
6. Inactiveer de trypsine door 3,5 mL cellijn-kweekmedium [Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), 1% penicilline/streptomycine en glutamine] toe te voegen. Centrifugeer 5 min bij 500 x g.
7. Verwijder het supernatant zodat er een pellet overblijft in ongeveer 20 µL medium. Transfer de organoïden in deze laatste kleine hoeveelheid medium naar een well van een 48-wellplaat.
8. Voeg high-titer lentivirus in transductiemedium toe, resuspendeer en ga door naar stap 3.10 bij een lage transductie-efficiëntie.
   OPMERKING: Voor een efficiënte transductie wordt doorgaans één aliquot van 250 µL high-titer lentivirus aan één well met organoïden toegevoegd. Dit komt overeen met 50% van al het geoogste lentivirus uit één productie.
9. Optioneel: om de transductie-efficiëntie te verhogen, kan spinoculatie worden uitgevoerd door de 48-wellplaat met organoïden in een voorverwarmde centrifuge op 32 °C te plaatsen en 1 uur te roteren bij 600 x g.
10. Plaats het organoïde-virusmengsel in een kweekincubator en incubeer dit 1 uur bij 37 °C om transductie mogelijk te maken.
11. Optioneel: om de transductie-efficiëntie verder te verhogen, kunnen de organoïden nogmaals 3 uur bij 37 °C in een kweekincubator worden geïncubeerd.
12. Voeg 1 mL organoïde-kweekmedium toe en resuspendeer het organoïde-virusmengsel; transfer dit naar een microcentrifugebuis en centrifugeer 5 min bij 850 x g in een microcentrifuge om de organoïden te pelletteren.
13. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 20 µL ijskoud Matrigel. Omdat het materiaal stolt bij opwarming, moeten pipetpunten worden gebruikt die zijn gekoeld door herhaaldelijk ijskoud PBS op en neer te pipetteren.
14. Plaats de druppel in het midden van een well in een 48-wellplaat en incubeer 15 min bij 37 °C in een kweekincubator om het materiaal te laten stollen.
15. Voeg na 15 min voorzichtig 250 µL organoïde-kweekmedium toe, aangevuld met 10 mM nicotinamide, 10 µM Chir99021 en 10 µM Y27632. Kleine gedisrugeerde organoïdefragmenten zullen binnen 24 uur uitgroeien tot kleine cystische organoïden.

Dag 5:

16. Vernieuw het medium en vul dit aan met een selectie van antibiotica (gebruik voor puromycine 4 µg/mL).

Dag 7:

1. Vervang het medium door standaard organoïdenkweekmedium, aangevuld met selectieantibioticum.
   OPMERKING: Het uitstulpen zal 2-3 weken na het staken van de Chir99021-toediening voltooid zijn. Na selectie kunnen organoïden worden gekweekt zonder selectieantibiotica.

Resultaten

Figuur 1: Schema van lentivirusproductie voor organoïde-transductie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Polyethyleenimine	Polysciences	23966-2
DMEM-medium	Lonza	BE12-614F
Foetaal kalfserum	Lonza	DE14-801F
Penicilline-streptomycine	Invitrogen	15140-122
Glutamine	Invitrogen	25030-024
Matrigel	BD	BD 356231
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acetylcysteïne	Sigma	A9165-1G
Muis Egf	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
Glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
Polybrene	Sigma	107689
Nicotinamide	Sigma	N0636
Trypsine	Lonza	BE02-007E