Detectie van SMAD-padactivatie met behulp van dubbele adenovirus-transductie

Samenvatting

Bron: Chen, H., et al. Live Cell Imaging of the TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (2018).

Deze video demonstreert een methode om de activatie van de SMAD-route in borstkankercellen te bestuderen met behulp van dubbele adenovirale infectie. Het ene virus levert een constitutief tot expressie gebracht gen voor GFP, terwijl het andere een RFP-reporter draagt onder een SMAD-gevoelige promoter. Na stimulatie met TGF-beta worden SMAD-eiwitten geactiveerd, waardoor een complex wordt gevormd dat RFP-expressie induceert. De detectie van dubbele signalen in levende cellen bevestigt de activatie van de route.

Protocol

1. Dubbele adenovirus-transductie in levende individuele cellen

1. Zaai 1,0 - 1,5 x 10⁵ MDA-MB-231 cellen met 500 μL Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) kweekmedium bevattende 5% foetaal runderserum (FBS) in elke put van een 12-wells plaat (35% celconfluentie, in totaal 2 wells).
2. Infecteer de cellen met 75 μL van de adenovirale vector Ad-CMV-GFP (titer = 5 x 10⁹ PFU/mL) en 7,5 μL van de adenovirale vector Ad-CAGA12-Td-Tom (titer = 5 x 10¹⁰ PFU/mL) om een multiplicity of infection (MOI) van 2.500 te verkrijgen, waarmee een infectiepositiviteit van 100% kan worden bereikt.
3. Behandel de cellen onmiddellijk na de adenovirale infectie met of zonder 0,25 μL transforming growth factor-beta (TGF-β) per put (voorraad 10 mg/mL, eindconcentratie 5 ng/μL).
4. Plaats de plaat gedurende 24 u in de incubator bij 37 °C met 10% CO₂.
5. Beeld de levende cellen af met een fasecontrast-fluorescentiemicroscoop. Exciteer green fluorescent protein (GFP) bij 470 nm en Td-Tomato-eiwit bij 554 nm.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DMEM	ThermoFisher	1881024	Voor gebruik opwarmen in waterbad van 37 °C
Foetaal runderserum	Scientifix Life	FBS500-S	Voor gebruik hitte-inactiveren
Recombinant humaan TGF-β1	PEPROTECH	100-21	Aliquoteren in DDW voor een eindconcentratie van 10 mg/mL
Fasecontrast-fluorescentiemicroscopie	OLYMPUS	IX50
MDA-MB-231	ATCC	CRM-HTB-26
Oplossing			Samenstelling
FBS-DMEM			5% hitte-inactief FBS; 10 μg/mL penicilline; 100 μg/mL streptomycine