Multiplexe fluorescentiebeeldvorming van virale nucleïnezuren en eiwitten in geïnfecteerde menselijke lymfocyten

Samenvatting

Bron: Shah, R., et al. Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection. J. Vis. Exp. (2020)

Deze video demonstreert de gelijktijdige visualisatie van HIV-1 DNA, RNA en capsid-eiwit in geïnfecteerde menselijke lymfocyten met behulp van branched DNA-hybridisatie en immunofluorescentie, waardoor een gedetailleerde analyse van de virale replicatiestadia binnen individuele cellen mogelijk is.

Protocol

1. Protein-immunokleuring: Om het of de eiwitten van belang te labelen

1. Giet de PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) af en voeg 200 µL blokkeringsbuffer (1% w/v BSA (runderserumalbumine), 10% v/v FBS (foetaal runderserum) in PBS met 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) toe aan het dekglas. Incubeer 1 h bij RT (kamertemperatuur).
2. Giet de blokkeringsbuffer af en breng 200 µL primair antilichaam aan, verdund in PBST + 1% w/v BSA. Incubeer 1 h bij RT.
3. Was het preparaat twee keer met PBST gedurende 10 min bij RT onder schudding.
4. Breng een secundair antilichaam naar keuze aan gedurende 1 h bij RT in PBST + 1% w/v BSA.
5. Was het preparaat met PBST gedurende 10 min bij RT onder schudding.

2. Kernkleuring: Tegenkleuring van de kernen na immunostaining

1. Giet de PBST af en breng DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) of een gewenste kernkleuring aan gedurende 1 min bij RT.
2. Was de slide tweemaal met PBS gedurende 10 min bij RT onder schudden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-HCV NS5a antilichaam	Abcam	ab13833	Muis monoklonaal; werkt met HCV-genotypen 1a, 1b, 3 en 4
Anti-HIV-1 p24 monoklonaal antilichaam	NIH AIDS Reagent Program	3537
Anti-Mov10 antilichaam	Abcam	ab80613	Konijn polyklonaal
Bovine serum albumine			Blokkeringsreagens voor immunostaining
Celmedium met supplementen			Medium geschikt voor het celmodel
Dekglasjes
DAPI	ACD Bio		Kernkleuring (RNAscope-kit van ACD Bio)
Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (1X PBS)	Gibco	14190250	Zonder calcium en magnesium
Foetaal bovien serum (FBS)			Gebruik specifiek FBS op basis van het serum waarin het secundaire antilichaam is opgewekt (bijv. geit FBS)
Fisherbrand colorfrost plus microscoopglaasjes	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	Voorgereinigd
Glaasjes
Tween-20			Voor DNA-hybridisatiebuffer en PBS-T