Zuivering van Prototype Foamy Virus-intasomen middels grootte-uitsluitingschromatografie

Samenvatting

Bron: Mackler, R. M., et al. Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes. J. Vis. Exp. (2018)

Deze video demonstreert de zuivering van prototype schuimvirus (PFV) intasomen uit een gemengde eiwit-DNA-suspensie met behulp van zoutextractie en grootte-uitsluitingschromatografie, wat resulteert in actieve complexen voor verdere analyse.

Protocol

1. Solubilisatie van intasomen

1. Bereid twee pipetpunten met een wijde opening voor door 2-4 mm van het uiteinde van een 200 µL punt te verwijderen met een nieuw scheermesje of scalpelmes op een schoon oppervlak.
   OPMERKING: De punten worden gebruikt in stap 1.3 en 1.5.
2. Verwijder de dialysebuis uit de dialysebuffer. Om verdunning van het intasome-monster met dialysebuffer die aan het uiteinde van de buis nabij de clip kan achterblijven te voorkomen, dient een micropipet met een kleine pipetpunt te worden gebruikt om overtollige dialysebuffer te verwijderen. Verwijder de clip aan één uiteinde van de dialysebuis.
3. Gebruik een pipetpunt met een wijde opening uit stap 1.1 om het monster, inclusief het neerslag in de dialysebuis, over te brengen naar een 1,5-mL buis op ijs. 
   OPMERKING: Het totale volume van het teruggewonnen materiaal is gewoonlijk ~140 µL.
4. Het monster met neerslag bevindt zich in 200 mM NaCl; verhoog de zoutconcentratie naar een eindconcentratie van 320 mM NaCl door het juiste volume van een 5 M NaCl-stamoplossing toe te voegen. Voor een monster van 150 µL moet bijvoorbeeld 3,9 µL 5 M NaCl en 1,1 µL ddH₂O worden toegevoegd voor een eindvolume van 155 µL. Plaats de ijsbak met het monster in een koelkamer van 4 ˚C.
5. Gebruik een pipetpunt met een wijde opening uit stap 1.1 om het neerslag door pipetteren opnieuw te suspenderen en te solubiliseren. Herhaal dit elke 20 min gedurende ten minste 1 u. Stel vast dat het grootste deel van het neerslag in oplossing moet gaan.
   OPMERKING: Het pipetteren om het neerslag opnieuw te suspenderen kan worden gestopt wanneer duidelijk is dat het neerslag tussen de tijdspunten niet langer merkbaar afneemt. Wanneer viraal DNA (vDNA) niet gelabeld of intern gelabeld is, neemt het neerslag op basis van visuele inspectie met ~90% af. In het geval van Cy5-uiteinde gelabeld vDNA neemt het neerslag slechts met ~20% af; het grootste deel van het neerslag met fluorofoor-uiteinde gelabeld vDNA zal niet solubiliseren. De hoeveelheid neerslag die effectief wordt gesolubiliseerd is variabel en moet empirisch worden bepaald.

2. Zuivering van intasomen

1. Bereid 250 mL runningbuffer voor grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) voor (20 mM Bis-tris propaan, pH 7,5, 320 mM NaCl, 10% glycerol). Filtreer de buffer steriel met een filtereenheid van 0,2 µm en bewaar deze bij 4 ˚C.
   OPMERKING: Alle zuiveringsstappen worden uitgevoerd in een koelruimte van 4 ˚C.
2. Equilibreer een cross-linked agarose SEC-kolom (diameter = 10 mm; lengte = 300 mm; bedvolume = 24 mL; monstervolume = 25 - 500 µL; maximale druk = 1,5 MPa; uitsluitingslimiet = 4 x 10⁷ Da; scheidt molecuulgewichten tussen 5 en 5.000 kDa, zie de Tabel met Materialen) met SEC-runningbuffer bij een stroomsnelheid van 0,4 mL/min.
   OPMERKING: Deze zuivering kan worden aangepast aan verschillende grootte-uitsluitingskolommen indien deze in staat zijn om 300 kDa effectief te scheiden van 44 kDa, zoals Superose 12 10/300 GL of Superose 6 Increase. Superose 12 10/300 GL heeft een lagere resolutie, wat leidt tot meer overlap van pieken. Omgekeerd heeft Superose 6 Increase een hogere resolutie en biedt deze een betere scheiding.
3. Centrifugeer het intasome-monster in een microcentrifuge bij 14.000 x g gedurende 10 min bij 4 ˚C om eventueel resterend neerslag te pelleteren. Verwijder voorzichtig het supernatant. Laad het supernatant in een injectielus van 200 µL (slang die ~200 μL kan bevatten). Breng het monster aan op de SEC-kolom.
   OPMERKING: Kleinere laadvolumes maken een hogere resolutie via SEC mogelijk.
4. Elueer met 25 mL SEC-runningbuffer en verzamel 95 fracties van 270 µL. Observeer dat het SEC-chromatogram drie A₂₈₀/A₂₆₀-pieken vertoont (Figuur 1).
   OPMERKING: De eerste zou een aggregaat moeten zijn (~9,0 - 11,5 mL elutie), gevolgd door de PFV-tetameer-intasome-piek (~12,0 - 14,75 mL elutie) en de PFV-IN-monomeer-piek met vrij vDNA (~15,0 - 18,0 mL).

Resultaten

Figuur 1: Grootte-uitsluitingschromatogram. Een PFV-intasoomassemblage werd gescheiden met een agarose SEC-kolom. Deze kolom maakt de scheiding mogelijk van het aggregaat (1), het PFV-intasoom bestaande uit een tetrameer van PFV IN en twee vDNA (2), en monomerisch PFV IN en vDNA (3). Dit voorbeeld bevatte vDNA met een interne Cy5-fluorofoorlabel gedetecteerd bij 650 nm excitatie. De y-as geeft de optische dichtheid (OD) weer in milli-absorbantie-eenheden (mAU).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DNA-oligomeren	IDT	N/A	Op maat gemaakte DNA-oligo's
NaCl	P212121	RP-S23020
BIS-TRIS propaan, >=99,0% (titratie)	Sigma-Aldrich	B6755-500G
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G37-20
Gel-loading tips, 1 - 200 μL	Corning	CLS4853-400EA
bassist; Enkelzijdig; 100/Pk.; Pak van 100	Fisher Scientific	12-640
Dialysesluisclips	Spectrum Labs	132734
6-8 kDa 10 mm dialysesluis	Spectrum Medical	132645
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	17517201