Het verkrijgen van viraal RNA voor real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR)-analyse

Samenvatting

Bron: Suzuki, Y., et al. Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction. J. Vis. Exp. (2018).

Deze video demonstreert de procedure voor het voorbereiden van virale monsters voor kwantitatieve PCR-analyse (Polymerase chain reaction). Virale monsters en RNA-standaarden worden serieel verdund, behandeld met een proteinase K-buffer en geïncubeerd onder gecontroleerde temperaturen om RNA vrij te maken. Het bewerkte RNA wordt vervolgens gestabiliseerd en bewaard voor kwantificering van de virale RNA-niveaus.

Protocol

1. Verwerking van virusmonsters voor RT-qPCR (Real-time kwantitatieve polymeraseketenreactie)

OPMERKING: De stappen 1.1–1.3 dienen te worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskabinet. In het bijzonder moet de omgang met het cultuursupernatans dat een infectieus virus bevat, plaatsvinden in een omgeving met biosafety level 2 (of hoger).

1. Meng 199 μL van een verwerkingsbuffer en 1 μL nucleasevrije proteinase K.
2. Verdun het gesynthetiseerde DENV (denguevirus) 3’UTR (untranslated region) RNA (ribonuclezuur) serieel in een verhouding van 1:10 om een RNA-standaard van 5 x 10⁹ tot 5 x 10³ kopieën/μL te verkrijgen met behulp van celcultuurmedium (bijv. DMEM (Dulbecco's modified eagle medium) aangevuld met 10% foetaal runderserum en antibiotica [DMEM/10% foetaal runderserum]) dat 40 units/mL RNase-remmer bevat.
3. Meng 5 μL van het cultuursupernatant van DENV-geïnfecteerde cellen en de DENV 3’UTR RNA-standaard met 5 μL van de verwerkingsbuffer/proteinase K-oplossing met behulp van PCR (polymerasekettingsreactie)-strips met 8 buisjes of een PCR-plaat met 96 putjes. Meng als non-template controle (NTC) 5 μL celcultuurmedium (d.w.z. zonder virus) met 5 μL van de verwerkingsbuffer/proteinase K-oplossing.
4. Na een korte centrifugatie worden de monsters geïncubeerd in een thermocycler volgens de volgende condities: 1 cyclus (van 25 °C gedurende 10 min en 75 °C gedurende 5 min).
OPMERKING: Verwerkte monsters kunnen bij 4 °C worden bewaard als de real-time PCR-analyse op dezelfde dag wordt uitgevoerd. Voor langdurige bewaring moeten de monsters bij -80 °C worden bewaard.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
SimpliAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A2481	Vergelijkbaar thermal cycler instrument, maar de PCR-cycluscondities moeten worden geoptimaliseerd.
Recombinant RNase Inhibitor	Takara Bio. Inc	2313A	40 units/μL
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	Een vergelijkbare RNA-purificatiekit kan worden gebruikt.
Proteinase K	Nacalai Tesque	15679-06	>60 units/mL. Een vergelijkbaar reagens kan worden gebruikt.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL	Thermo Fisher Scientific	4346907	Afhankelijk van het real-time PCR-instrument kan een vergelijkbare plaat of buis worden gebruikt, maar de PCR-cycluscondities moeten worden geoptimaliseerd.