Oogsten van hepatitis E-virusdeeltjes uit menselijke leverkankercellen

Samenvatting

Bron: Meister, T. L., et al. A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks. J. Vis. Exp. (2020).

Deze video demonstreert het proces van het isoleren van hepatitis E-virus (HEV) deeltjes uit getransfecteerde humane hepatocellulaire carcinoomcellen. Extracellulaire virusdeeltjes worden verzameld uit gefiltreerde supernatanten, terwijl intracellulaire deeltjes worden vrijgemaakt door de cellen bloot te stellen aan herhaalde vries-dooi-cycli. Het lysaat wordt gecentrifugeerd, en de supernatant die HEV-deeltjes bevat, wordt in aliquoten verdeeld en bewaard bij een ultralage temperatuur voor toekomstig gebruik

Protocol

1. Voorbereiding van HepG2-cellen voor de productie van celcultuur-afgeleid HEV (HEVcc)
OPMERKING: Om contaminatie te voorkomen, werden de celvoorbereiding, electroporatie, infectie, oogsten en celfixatie uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een faciliteit voor bioveiligheidsniveau 2. Incubatiestappen bij 37 °C met cellen werden uitgevoerd in een 5% CO₂-incubator.

1. Om HepG2-cellen voor te bereiden voor HEVcc-productie (Figuur 1), zaai de cellen in compleet Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (zie Tabel 1) uit op een met collageen gecoate kweekschaal van 15 cm (zie Tabel 1, filter een steriele mix van fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en azijnzuur door een 0,2 µm gaas voordat het collageen wordt toegevoegd). Incubeer bij 37 °C totdat de cellen 90% confluent zijn.
   OPMERKING: Elke schaal van 15 cm met 90% confluente cellen levert voldoende cellen op voor maximaal 4 elektroporaties.
2. Verwijder voorzichtig het medium van de plaat en was de cellen één keer met 10 mL 1x PBS. Trypsiniseer de cellen door 3 mL 0,05% trypsine-EDTA op de cellen toe te voegen en incubeer bij 37 °C totdat de cellen volledig zijn losgelaten. Resuspendeer de cellen in 10 mL compleet DMEM-medium en breng de celsuspensie over in een buis van 50 mL. Bepaal het totale aantal cellen.
3. Aangezien elke elektroporatie 5 x 10⁶ cellen vereist, brengt u het juiste volume over in een nieuwe buis van 50 mL en vult u deze aan tot ten minste 35 mL met 1x PBS. Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 min en verwijder voorzichtig het supernatant zonder de celpellet te verstoren.
4. Was de cellen nogmaals met 35 mL 1x PBS bij 200 x g gedurende 5 min. Plaats de cellen op ijs en verwijder de 1x PBS nog niet, om de cellen in suspensie te houden.

2. Electroporatie van HepG2-cellen

1. Bereid voor electroporatie van HepG2-cellen (Figuur 2) 400 µL Cytomix complete per electroporatie voor door 384 µL Cytomix (zie Tabel 1) aan te vullen met 2 mM ATP en 5 mM Glutathione. Bereid dit vers vlak voor gebruik en plaats het direct op ijs.
   OPMERKING: Een correcte en snelle uitvoering van de volgende stappen is cruciaal. Zorg er daarom voor dat alles correct is voorbereid.
2. Verwijder voorzichtig 1x PBS zonder het celpellet uit stap 4.4 te verstoren. Resuspendeer 5 x 10⁶ cellen in 400 µL Cytomix complete en voeg 5 µg RNA toe. Overbreng de oplossing naar een cuvette van 4 mm en geef één puls van 975 µF, 270 V gedurende 20 ms met een electroporatiesysteem.
   1. Overbreng na de electroporatie de cellen zo snel mogelijk met een Pasteur-pipet naar 11 mL compleet DMEM per electroporatie.
      OPMERKING: Om er zeker van te zijn dat het RNA succesvol is getransfecteerd in de HepG2-cellen, wordt een transfectiecontrole (TC) uitgevoerd. De verwachte transfectiepercentages variëren tussen 40-60% ORF2-positieve cellen.
3. Overbreng 10 mL van de ge-electroporeerde cellen naar een 10 cm kweekschaal die is gecoat met collageen. Voeg 1,3 x 10⁵ ge-electroporeerde cellen (300 µL) toe aan één well van een met collageen gecoate 24-microtiterplaat met een dekglas (later gebruikt als transfectiecontrole). Verdeel de cellen gelijkmatig en incubeer bij 37 °C.
   1. Vervang na 24 u het medium in de 10 cm schaal door 10 mL vers compleet DMEM. Ververs het medium van de transfectiecontrole niet. Incubeer nog eens 6 dagen bij 37 °C.

3. Oogsten van intra- en extracellulaire celcultuur-afgeleide HEV (HEVcc)

1. Om extracellulair HEVcc te oogsten (Figure 3), wordt het supernatant dat na 6 dagen uit de 10 cm schaal is verkregen gefilterd door een 0,45 µm gaas om eventuele celdebris te verwijderen. Bewaar geoogst extracellulair HEVcc bij 4 °C voor infectie op dezelfde dag; bewaar het anders bij -80 °C.
2. Om intracellulair HEVcc te oogsten (Figure 3), worden de cellen gewassen met 1x PBS en getrypsineerd door toevoeging van 1,5 mL 0,05% trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (trypsine-EDTA). Incubeer bij 37 °C totdat de cellen volledig zijn losgekomen. Voeg 10 mL compleet DMEM toe, spoel de plaat om de cellen los te maken en breng de celsuspensie over in een 50 mL buis. Was de cellen twee keer met PBS. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min.
   1. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de celpellet in 1,6 mL compleet DMEM per electroporatie. Breng de celsuspensie over in een reactiebuis van 2 mL.
      OPMERKING: Gebruik geen grotere volumes, omdat dit de virale load aanzienlijk zou verlagen.
   2. Bevries de cellen (in vloeibare stikstof) en ontdooi ze. Herhaal deze reeks 3 keer.
      OPMERKING: Voeg niet meer dan één electroporatie (1,6 mL) samen voor de 3 vries-dooi-cycli, omdat de lyse-efficiëntie anders zou worden belemmerd. Vortex de celsuspensie niet tussen de cycli door. Zorg ervoor dat de celsuspensie langzaam wordt ontdooid (bijv. bij kamertemperatuur of op ijs) om de virale load te maximaliseren.
   3. Centrifugeer de gelyseerde cellen op hoge snelheid gedurende 10 min bij 10.000 x g om celdebris te scheiden. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis. Gebruik het supernatant voor infectie; bewaar het anders bij -80 °C.
   4. Optioneel kan het extra- en intracellulaire HEVcc worden geconcentreerd met een concentrator om de virale load te verhogen.

Tabel 1: Tabel met buffersamenstelling.

Werkoplossing	Concentratie	Volume
Collageen	40 mL	PBS
	40 µl	Azijnzuur
	1 mL	Steriele collageen R-oplossing 0,4%
Cytomix	120 mM	KCl
	0,15 mM	CaCl22
	10 mM	K2HPO4 (pH 7,4)
	25 mM	HEPES
	2 mM	EGTA
compleet DMEM	500 mL	DMEM
	5 mL	Pen/Strep
	5 mL	MEM NEAA (100X)
	5 mL	L-glutamine
	50 mL	Foetaal runderserum
compleet MEM	500 mL	MEM
	5 mL	Natriumpyruvaat
	5 mL	Gentamicine
	5 mL	MEM NEAA (100X)
	5 mL	L-glutamine
	50 mL	ultra-lage IgG

Resultaten

Figuur 1: Schematische experimentele opstelling voor de preparatie van HepG2-cellen voor de productie van kweek-gederiveerd HEV (HEVcc).

Figuur 2: Schematische experimentele opstelling voor de elektroporatie van HepG2-cellen.

Figuur 3: Schematische experimentele opstelling voor het oogsten van intra- en extracellulair HEVcc.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.45 µm mesh	Sarstedt	83.1826	Oogsten van extracellulair virus
MEM	gibco	31095-029	Celkweek
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Celkweek
Trypsin-EDTA (0.5 %)	gibco	15400054	Celkweek
ultra-low IgG	gibco	1921005PJ	Celkweek
Azijnzuur	CarlRoth	6755.1	Collageen-werkoplossing
ATP	Roche	11140965001	In vitro transcriptie en elektroporatie
BioRender	BioRender		Genereren van figuren
Calciumchloride	Roth	5239.2	Cytomix
Collageen R oplossing 0.4 % steriel	Serva	47256.01	Collageen-werkoplossing
DMEM	gibco	41965-039	Celkweek
EGTA	Roth	3054.3	Cytomix
GenePulser Xcell Electroporation System	BioRad	1652660	Elektroporatie
HEPES	Invitrogen	15630-03	Cytomix
Dikaliumwaterstoffosfaat	Roth	P749.1	Cytomix
KCL	Roth	6781.3	Cytomix
Kaliumdihydrogenfosfaat	Roth	3904.2	Cytomix
L-Glutamine	gibco	25030081	Celkweek
L-Glutathion gereduceerd	Sigma-Aldrich	G4251-5G	Cytomix
MEM	gibco	31095-029	Celkweek
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Celkweek
Magnesiumchloride	Roth	2189.2	Cytomix
Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	DNA/RNA-concentratie
PBS	gibco	70011051	Celkweek
Pen/Strep	Thermo Fisher	15140122	Celkweek