Zuivering van virus uit de allantoïsvloeistof van embryonerende kippeneieren

Samenvatting

Bron: Yates, J. G. E., et al. Productie van recombinant Newcastle disease-virus met een hoge titer uit allantoïsvloeistof. J. Vis. Exp. (202)

De video demonstreert de zuivering en concentratie van viruspartikels uit geklaarde allantoïsvloeistof, verzameld uit virus-geïnfecteerde geëmbyoneerde kippeneieren. Er wordt een reeks filtratie- en scheidingsstappen getoond, waaronder dieptefiltratie, tangential flow-filtratie en dichtheidsgradiënt-ultracentrifugatie om intacte virussen te isoleren. De virusrijke fractie wordt vervolgens gedialyseerd om resterende zouten en gradiëntcomponenten door diffusie te verwijderen, gevolgd door concentratie met een hypertone oplossing via osmose. Het resultaat is een gezuiverde viruspreparaat met een hoge titer, geschikt voor experimenteel gebruik.

Protocol

1. Amplificatie van het Newcastle disease virus (NDV) met behulp van specifieke pathogeenvrije geëmbryoneerde kippeneieren

1. Inoculatie van specifieke pathogeen-vrije (SPF) gebemiste kippeneieren
   OPMERKING: Normaal gesproken worden acht dozijn SPF gebemiste kippeneieren gebruikt om één batch Newcastle disease virus (NDV) van in vivo-kwaliteit te produceren. Bestel één of twee dozijn extra eieren om rekening te houden met beschadigingen tijdens transport, alsmede variabiliteit in levensvatbaarheid.
   1. Incubeer de SPF gebemiste kippeneieren na ontvangst in een eierincubator bij 37 °C en 60% luchtvochtigheid gedurende 9 dagen. Zorg ervoor dat de incubator zo is ingesteld dat de eieren elk uur automatisch worden geschut/gedraaid.
      OPMERKING: Eieren kunnen tot 24 u bij kamertemperatuur of tot 72 u bij 4 °C worden bewaard; dit kan echter de levensvatbaarheid van het embryo verminderen.
   2. Voer na 8-1 dagen incubatie (idealiter op dag 9) een zaklampcontrole (candling) uit op de eieren om de levensvatbaarheid van het embryo te bepalen. Let op webachtige vascularisatie (Figuur 1A) en beweging van het embryo als indicatoren voor levensvatbare embryo's. Verwijder eieren die deze kenmerken missen (Figuur 1B).
   3. Markeer bij de levensvatbare eieren de overgang tussen de luchtzak en het embryo met een 'X' in potlood (Figuur 1A). Zorg ervoor dat deze injectieplaats geen perforatie van de vascularisatie zal veroorzaken. Plaats de gemarkeerde eieren terug in de incubator terwijl het inoculum wordt voorbereid.
   4. Bereken de hoeveelheid virus die nodig is om alle SPF gebemiste kippeneieren te injecteren. Zorg ervoor dat elk ei 10 plaque-vormende eenheden (PFU) virus ontvangt in een volume van 10 µL; verdun het virus in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot een concentratie van 1 × 10³ PFU/mL. Bereid 20% extra inoculum voor om rekening te houden met onnauwkeurigheden bij de toediening van het virus.
   5. Reinig de bovenkant van de gemarkeerde eieren met een antistatisch doekje en een 10% jodiumoplossing verdund in 70% ethanol. Wacht ongeveer 1-2 minuten tot de oplossing is opgedroogd.
   6. Doorboor de schaal voorzichtig met een steriele, scherpe pincet. Desinfecteer de pincet in 70% ethanol tussen de eieren door.
   7. Injecteer met een spuit van 1 mL en een 25 G naald 100 µL van het in stap 1.1.4 voorbereide inoculum in de chorio-allantoïsche holte (Figuur 1C). Benader het ei met de naald in een hoek van bijna 90°. Steek de naald net in de bovenkant van het chorio-allantoïsche membraan.
   8. Dek na inoculatie de insteekplaats af met nagellak en plaats de eieren terug in de incubator. Zorg ervoor dat de schutinstelling AAN staat tot 24 u na inoculatie.
   9. Controleer de levensvatbaarheid van de eieren 24 u na inoculatie. Verwijder dode eieren die geen vascularisatie in het chorio-allantoïsche membraan en geen beweging van het embryo vertonen (Figuur 1B).
      OPMERKING: Deze eieren zijn gestorven door het inoculatieproces en niet door NDV.
   10. Plaats de eieren terug in de incubator, waarbij de schutinstelling UIT staat om contaminatie van het allantoïsche vocht met eiwitten uit het ei te voorkomen.
   11. Controleer de eieren elke 12-24 u zoals beschreven in stap 1.1.9 om dode eieren te identificeren. Verplaats eieren die na 24 u na inoculatie sterven naar 4 °C om autolyse te minimaliseren. Oogst het allantoïsche vocht binnen 2-12 u na het koelen.
   12. Incubeer de eieren gedurende ten minste 72 u.
       OPMERKING: Bij de propagatie van een mesogene NDV-stam is de optimale incubatietijd 60-72 u, aangezien langere incubatietijden het zuiveringsproces kunnen belemmeren door een verminderde helderheid van het allantoïsche vocht. Dit probleem is minder relevant bij de propagatie van lentogene NDV-stammen, omdat deze veel langer doen over het doden van het embryo.
   13. Verplaats de overgebleven eieren na de juiste incubatieperiode gedurende 2-12 u naar 4 °C voordat het allantoïsche vocht wordt geoogst.
2. Oogsten van allantoïsch vocht dat NDV bevat
   1. Verplaats de gekoelde eieren naar de veiligheidskast. Reinig de bovenkant van de eieren met 70% ethanol.
   2. Gebruik een steriele pincet en chirurgische scharen om de apicale zijde van het ei, waar de luchtzak zich bevindt, open te breken.
   3. Verwijder de schaal om het chorio-allantoïsche membraan bloot te leggen (Figuur 1D).
   4. Doorboor het membraan voorzichtig en pel het terug om de allantoïsche holte bloot te leggen (Figuur 1E). Zorg ervoor dat de dooierzak niet per ongeluk wordt doorboord, omdat dit het ei zal bederven.
   5. Gebruik stompe forceps om het embryo vast te pakken en de embryonale zak te openen.
      OPMERKING: Het vocht in de embryonale zak bevat ook NDV.
   6. Druk het embryo met de forceps weg en verzamel het allantoïsche vocht met een serologische pipet van 10 mL.
   7. Bewaar het allantoïsche vocht op ijs in conische buizen van 15 mL tot de klaring.
      OPMERKING: Als het allantoïsche vocht geel is, is de dooierzak beschadigd en moet het allantoïsche vocht worden weggegooid.
   8. Centrifugeer de conische buizen met het allantoïsche vocht bij 1.50 × g gedurende 10 min bij 4 °C.
   9. Pausepunt: Verdeel het geklaarde allantoïsche vocht over conische buizen van 50 mL en bewaar deze bij -80 °C voor langdurige bewaring (bijv. weken tot maanden), waarbij het vocht wordt aangevuld met sucrose tot een eindconcentratie van 5% om het virus te beschermen tegen de schadelijke effecten van vries-dooi-cycli. Voor kortstondige bewaring (bijv. 1-3 dagen) kan het allantoïsche vocht vóór bewaring bij 4 °C worden aangevuld met sucrose (eindconcentratie 5%) of met 3× Mannitol-Lysine (ML) buffer (15% Mannitol, 3% Lysine) om een eindconcentratie van 1× (5% Mannitol, 1% Lysine) te verkrijgen.

2. Zuivering van NDV uit allantoïsvloeistof

1. Dieptefiltratie van allantoïsvloeistof
   1. Bewaar het geklaarde allantoïsvloeistof bij -80 °C en ontdooi het bij 4 °C de avond voor het zuiveren.
   2. Stel in een biologische veiligheidskabinet de slangen en de peristaltische pomp in zoals weergegeven in Figuur 2.
   3. Indien dit nog niet is gedaan, combineer het allantoïsvloeistof met 3× ML-buffer tot een eindconcentratie van 1×.
   4. Steriliseer de slang voor het bevestigen van het dieptefilter door 50 mL 0,5 M natriumhydroxide (NaOH) door het systeem in een afvalvat te leiden.
   5. Spoel de slang door 10 mL steriel water van moleculaire kwaliteit door het systeem en in het afvalreservoir.
      OPMERKING: Aangezien NaOH het NDV zal inactiveren, is het belangrijk dat de leidingen adequaat worden gespoeld voordat het virusbevattende allantoïsfluidum wordt toegevoegd.
   6. Prepare het systeem door 50 mL PBS erdoorheen te pompen en stop de pomp wanneer er nog ongeveer 5 mL PBS in de buis over is.
   7. Bevestig een dieptefilter met een 1-3 µM retentieklasse van de slang en verwijder de tweede dop aan de apicale zijde van het dieptefilter om het filter te ontluchten. Begin met het doorstromen van nog eens 50 mL PBS door het systeem.
   8. Zodra de PBS door de ontluchting aan de bovenkant van het filter begint te stromen, sluit u de poort en laat u de PBS verder door de leidingen stromen.
      OPMERKING: Kleine luchtbellen zijn acceptabel, maar bij de aanwezigheid van grote hoeveelheden lucht moet het filter opnieuw worden ontlucht, zoals beschreven in stappen 2.1.7 en 2.1.8.
   9. Stop de pomp wanneer er ongeveer 5 mL PBS in de buis overblijft.
   10. Vervang het afvalreservoir door een nieuw steriel opvangreservoir en begin met het filteren van de allantoïsvloeistof door het dieptefilter.
       OPMERKING: De druk mag 10 psi niet overschrijden, omdat dit leidt tot afscheuring van het virus. De druk kan worden aangepast door de stroomsnelheid van de pomp te verlagen of te verhogen. Als de druk begint te stijgen tot boven de 10 psi en de stroomsnelheid niet verder kan worden verlaagd, moet er een nieuw dieptefilter worden gebruikt. In dat geval moeten stappen 2.1.6-2.1.8 worden uitgevoerd voordat de stroom allantoïsvloeistof wordt hervat.
   11. Zodra al het allantoïsvloeistof door het filter is gegaan, spoel je 50 mL van 1× ML-buffer door de leidingen om het virusherstel te maximaliseren.
   12. Verzamel de vloeistof totdat de lijnen droogstaan. Bewaar het virus gedurende de nacht of tot maximaal 36 uur bij 4 °C.
       OPMERKING: Zodra het virus via dieptefiltratie is gefilterd, dient het zuiveringsproces binnen 36 uur na voltooiing van de dieptefiltratie te worden voortgezet.
   13. Koppel het dieptefilter los en desinfecteer de slang door 10 mL 0,5 M NaOH en 40 parts per million (ppm) bleekmiddel door te spoelen, vooraf opgewarmd tot 42 °C door het systeem voordat het wordt opgeslagen in 0,5 M NaOH.
2. Tangentiële stroomfiltratie voor de concentratie van NDV
   1. Stel de componenten van de cassette samen zoals afgebeeld in Figuur 3A in een biologische veiligheidskabinet.
      OPMERKING: Het verdeelstuk en de eindplaat moeten voor gebruik met detergent worden gewassen en gedroogd. De siliconen pakkingen zijn herbruikbaar en moeten samen met de cassette in 0,5 M NaOH worden bewaard.
   2. Stel het systeem voor tangentiële stroomfiltratie (TFF) (ook wel cross-flowfiltratie genoemd) in een 'open' configuratie in (Figuur 3B).
      1. Als de cassette voor het eerst wordt gebruikt, assembleer de TFF-cassette in de elutieconfiguratie en spoel deze door met 10 mL steriel water van moleculaire kwaliteit (Figuur 3C).
      2. Zodra er nog slechts 5 ml water in het reservoirreservoir is overgebleven, dient u de pomp te pauzeren en de opstelling van het TFF-systeem te wijzigen naar een gesloten configuratie (Figuur 3D).
      3. Voeg 10 ml 0,5 M NaOH toe, met 40 ppm bleekmiddel, vooraf voorverwarmd tot 42 °C naar het reservoir en gedurende 30-60 min. door het systeem laten circuleren.
      4. Pauzeer de stroom en plaats het TFF-systeem terug in de elutie-opstelling, waarna de stroom wordt hervat om de reinigingsoplossing te elueren.
      5. Wanneer er ongeveer 5 mL in het reservoir over is, pauzeer dan de pomp en voeg 10 mL steriel water van moleculaire kwaliteit toe om het systeem te spoelen.
      6. Wanneer er ongeveer 5 mL in het reservoir overblijft, pauzeer dan de pomp en zet het TFF-systeem in de open stand (Figuur 3B). Ga verder met stap 2.2.3.
   3. Steriliseer de cassette en de slang door 100 mL 0,5 M NaOH met behulp van de peristaltische pomp door het systeem te leiden. Zorg ervoor dat de druk 30 psi niet overschrijdt om de integriteit van de cassette te behouden.
   4. Pauzeer de pomp wanneer er ongeveer 5 mL 0,5 M NaOH in het reservoir over is.
   5. Voeg 10 mL steriel water van moleculaire graad toe aan het reservoir en hervat het passeren van de vloeistof door de cassette. Draai het reservoir rond om alle NaOH van de wanden te spoelen om inactivatie van het virus te voorkomen. Herhaal de stap van het spoelen van het reservoir.
   6. Wanneer er ongeveer 5 mL steriel water van moleculaire kwaliteit in het reservoir over is, wordt de pomp gepauzeerd.
   7. Voeg 10 mL PBS toe aan het reservoir en draai dit voorzichtig rond om ervoor te zorgen dat het steriele water van moleculaire kwaliteit van de wanden wordt weggespoeld. Hervat de vloeistofstroom door de cassette.
   8. Wanneer er ongeveer 5 mL in het reservoir over is, wordt de pomp gepauzeerd, wordt er dieptegefiltereerd allantoïs-vocht aan het reservoir toegevoegd en wordt de pompstroom hervat.
   9. Houd drukmeter 1 in de gaten (Figuur 3B) om ervoor te zorgen dat deze 10 psi niet overschrijdt om afschuiving van het virus te voorkomen. Gebruik een combinatie van de snelheid van de peristaltische pomp en C-klemmen om de elutie naar de afvalstroom te verhogen.
      OPMERKING: Het combineren van de snelheid van de peristaltische pomp en de C-klemmen zal leiden tot een verhoogde druk.
   10. Wanneer er nog 50-10 mL allantoïsvloeistof in het reservoir over is, wordt de pomp gepauzeerd om een bufferuitwisseling uit te voeren door 150-200 mL van 1× ML-buffer.
   11. Zet de pompplood weer aan en houd opnieuw drukmeter 1 in de gaten (Figuur 3B) om ervoor te zorgen dat deze 10 psi niet overschrijdt.
   12. Wanneer er nog 5-10 mL in het reservoir over is, wordt de pomp gepauzeerd.
   13. Sluit de twee afvalleidingen met twee C-klemmen, zoals weergegeven in Figuur 3C.
   14. Koppel de retentaatleiding die het reservoir voedt los en plaats deze in een conische buis van 50 mL (Figuur 3C).
   15. Zet de pompstroom weer voort en pauzeer wanneer er nog enkele druppels vloeistof in de reservoirtank over zijn.
   16. Verwijder de C-klemmen van de afvoerleidingen en sluit de retentaat-toevoerleiding opnieuw aan op de reservoirtank (Figuur 3B).
   17. Voeg 20-25 mL van 1 toe× ML-buffer en hervat de pompstroom totdat er ongeveer 5 mL over is in het reservoirreservoir.
   18. Herhaal stappen 2.2.13 tot en met 2.2.16.
       OPMERKING: Een derde elutie kan worden uitgevoerd door stappen 2.2.17 en 2.2.13 tot en met 2.2.16 te herhalen om de virusopbrengst te verhogen. Het grootste deel van het virus is echter aanwezig in de eerste twee eluties.
   19. Plaats het virus na voltooiing van de eluties op ijs of bij 4 °C.
   20. Om de leidingen te reinigen, wordt het systeem zo geconfigureerd dat het een gesloten lus vormt (Figuur 3D) waarbij de afvoerleidingen terugvloeien naar het reservoir, zoals weergegeven in Figuur 3D.
   21. Reinig het systeem vervolgens door 250 mL 0,5 M NaOH toe te voegen, met 400 ppm bleekmiddel, vooraf opgewarmd tot 42 °C.
   22. Laat de reinigingsoplossing gedurende de nacht door het systeem stromen.
       OPMERKING: Tijdens het recirculeren van de reinigingsoplossing moet, wanneer de pomp op een snelheid van 50 ml/min wordt bedreven, een druk van ongeveer 5 psi worden waargenomen. Indien de druk dit overschrijdt, is de cassette vervuild en dient de reinigingsoplossing te worden vervangen en het proces te worden herhaald.
   23. Elueer de reinigingsoplossing door zowel de afvoerlijnen als de retentaatlijn naar een afvalcontainer te leiden.
   24. Voeg 40-50 mL steriel water toe aan het reservoir en laat dit door het systeem en in de afvalvaten stromen.
   25. Wanneer er ongeveer 5 mL in het reservoir overblijft, pauzeer dan de pomp en voeg 10-20 mL 0,5 M NaOH toe aan de reservoirtank; draai de oplossing rond om de reservoircontainer te wassen.
   26. Zodra het reservoir bijna leeg is, wordt stap 2.2.23 nog twee keer herhaald.
   27. Demonteer de TFF-opstelling en bewaar de TFF-cassette en pakkingen in een klein volume 0,5 M NaOH in een afsluitbare plastic zak bij 4 °C.
       OPMERKING: Slangen kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard, ondergedompeld in 0,5 M NaOH.
3. Iodixanol-dichtheidsgradiënt-ultracentrifugatie
   1. Zet de ultracentrifuge aan en stel deze in op voorkoelen naar 4 °CKoel de gewenste rotor vooraf af op 4 °C eveneens (zie de Tabel van materialen).
      OPMERKING: Rotoren dienen te worden bewaard bij 4 °C.
   2. Gebruik de stockoplossing van 60% iodixanol (concentratie bij aankoop) om 40%, 20% en 10% iodixanoloplossingen te maken door verdunning met PBS en 3× ML-buffer tot een 1× eindconcentratie van ML-buffer.
   3. In een ultracentrifugebuis met dunne wand van 13,2 mL en open bovenkant, brengt men respectievelijk 0,5 mL, 2,5 mL en 2,5 mL van de 40%, 20% en 10% iodixanoloplossingen aan als overlaag (Figuur 4A).
      OPMERKING: Door de ultracentrifugebuis op zijn zij te kantelen en de oplossing langzaam uit te stoten, wordt het risico op menging van de twee gradiëntlagen aanzienlijk verkleind. De scheiding van elke laag moet duidelijk zichtbaar zijn, met een "halo" zichtbaar tussen elke laag van de gradiënt.
   4. Gebruik een markeerstift om de grensvlakken van de verschillende gradiëntlagen te markeren.
   5. Breng 6-6,5 mL van het geëlueerde virus uit de TFF-procedure voorzichtig aan bovenop de dichtheidsgradiënt. Voeg het virus zorgvuldig toe, zoals beschreven in stap 2.3.3, om te voorkomen dat de dichtheidsgradiënt wordt verstoord.
   6. Plaats de ultracentrifugebuizen in de inserts voor de swinging-bucket-rotor (zie de Tabel met materialen) gebruik een open weegschaal om de inserts tot op 0,01 g nauwkeurig op elkaar af te stemmen. Gebruik PBS of extra viruseluent om de gewichtsverschillen te compenseren.
   7. Zodra de buizen in balans zijn, sluit u de buizen af en plaatst u ze in de rotor.
   8. Centrifuge gedurende 1,5 uur bij 125.0 × g bij 4 °C.
      OPMERKING: Dit kan gedurende de nacht worden uitgevoerd indien een ultracentrifuge met een vertraagde startfunctie beschikbaar is.
   9. Verwijder na ultracentrifugatie de buisjes met een steriele pincet. Zoek naar de doelband, een brede band tussen de 10% en 20% gradiënten (Figuur 4B).
   10. Hang de buis met behulp van een statief boven een bekerglas.
   11. Bevestig een 18 G × bevestig een naald van 1,5 inch aan een spuit van 5 mL en doorboor de zijkant van de ultracentrifugebuis.
       OPMERKING: De buis moet net onder de doelband worden doorprikt, waarbij de naald in een opwaartse hoek en met de schuinkant naar boven wordt geplaatst, zodat deze de doelband in beweegt.
   12. Duw de zuiger langzaam uit om de doellijn te verwijderen.
       OPMERKING: Beweeg de naald binnen de doelbband om de extractie van het virus te maximaliseren. Let erop dat andere banden of debris niet met de doelband worden gemengd en voorkom het opnemen van overtollige oplossing, aangezien dit leidt tot het gebruik van meer dialyse cassettes.
   13. Zodra de doellband is geëxtraheerd, verwijdert u de naald en laat u de resterende oplossing in het afvalbekerglas lopen. Breng de doellband over in een conische buis van 50 ml, totdat alle banden uit alle overige ultracentrifugebuizen zijn geëxtraheerd.
   14. Herhaal stappen 2.3.10-2.3.13 totdat alle doelbanden uit alle ultracentrifugebuizen zijn geëxtraheerd.
   15. Alternatieve methode voor het extraheren van de doelbanden zoals beschreven in stappen 2.3.10 tot 2.3.13
       1. Verwijder langzaam de vloeistof boven de doellijn met een pipette. Zodra de doellijn is bereikt, wordt deze met een pipette geëxtraheerd en wordt het virus bewaard in een conische buis van 50 ml.
          OPMERKING: Dit maakt het mogelijk om de ultracentrifugebuisjes opnieuw te gebruiken.
4. Verwijdering van iodixanol uit de virusoplossing
   OPMERKING: De NDV-bevattende band verschijnt bij een iodixanol-densiteit tussen 15% en 16%. De concentratie iodixanol in de oplossing kan worden bepaald door de absorptie bij 340 nm te meten aan de hand van een standaardcurve. Deze stap kan worden weggelaten, aangezien er geen nadelige effecten of acute toxiciteit werden waargenomen wanneer iodixanol-oplossingen van deze concentratie aan C57BL/6-muizen werden toegediend.
   1. Maak een dialyse cassette van 0,5-3 mL met een molecular weight cut-off van 10 kDa vooraf nat door deze gedurende 1 minuut in PBS onder te dompelen.
      OPMERKING: Het dialysemembraan zou moeten veranderen van een glad naar een gerimpeld of hobbelig uiterlijk. Als het volume van het geëxtraheerde virus 10 mL overschrijdt, moeten twee dialysecassettes van 0,5-3 mL of één dialysecassette van 5-12 mL worden gebruikt.
   2. Gebruik, indien van toepassing, een spuit van 5 of 10 mL en een 18 G naald × 1,5 inch stompe vulnaald om het virus uit de 50 mL conische buis te verzamelen.
   3. Gebruik de spuit om de dialysekassette binnen te gaan, waarbij u er op moet letten dat u het membraan niet doorprikt, en injecteer het virus.
      OPMERKING: De dialysekassette kan worden gedraaid om de positie van de luchtbel in de kassette te manipuleren. De luchtbel moet worden verwijderd voordat de naald uit de kassette wordt gehaald.
   4. Vul een bekerglas van 1 L met steriele 1× PBS, plaats een roerpaltje en de dialysecassette erin en sluit af. Incubeer bij 4 °C onder voorzichtig roeren.
      OPMERKING: Gebruik geëxtrudeerd polystyreenschuim en een elastiek om de dialysekassette te bevestigen zodat deze in de PBS blijft drijven. De kassette kan enigszins opzwellen door de ML-buffer.
   5. Vervang dit na 1-2 uur door verse 1× PBS en continue met incuberen bij 4 °C nog 8-10 uur met licht roeren.
      OPMERKING: Dit kan eventueel ook gedurende de nacht worden gedaan.
   6. Vervang door verse 1× PBS nogmaals, incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1-2 u.
5. Concentratie van virusoplossing
   1. Verwijder de dialyse cassette uit de dialysebuffer (Figuur 4C) en plaats deze in een klein, afsluitbaar plastic zakje. Voeg 15-25 mL 40% polyethyleenglycol van 20.0 MW toe, zodat de dialysekassette volledig is ondergedompeld.
   2. Incubeer bij kamertemperatuur onder schudden. Controleer periodiek het volume van het virus in de cassette met een spuit van 5 of 10 mL en een 18 G naald. × Blunt-fill naald van 1,5 inch.
      OPMERKING: De benodigde tijd om het virus te concentreren varieert afhankelijk van het startvolume en het gewenste eindvolume. Gewoonlijk ligt het gewenste uiteindelijke volume tussen 1 en 1,5 ml, ongeacht het startvolume van het allantoïsvloeistof. Let bij het controleren van het volume op dat u niet dezelfde poort gebruikt, aangezien dit de integriteit van de poort in gevaar brengt en kan leiden tot vermenging van de polyethyleenglycoloplossing en het virus.
   3. Spoel de cassette kort af in 1 voordat u het geconcentreerde virus uit de dialysecassette verwijdert.× PBS en vul een 18 G × 1,5 inch stompe vulnaald met lucht.
   4. Plaats de luchtgevulde spuit in de dialysecassette en druk op de zuiger. Draai het apparaat zodanig dat het geconcentreerde virus verwijderd kan worden zonder dat er lucht wordt onttrokken.
   5. Dispenseer het geconcentreerde virus in een conische buis van 50 ml en noteer het gedispenseerde volume.
   6. Injecteer met dezelfde spuit en naald een passende hoeveelheid 60% sucrose in de dialysekasette, zodanig dat de uiteindelijke concentratie 5% sucrose is wanneer dit gecombineerd wordt met het eerder verwijderde virus.
   7. Masseer de membraan met handschoenen aan om resterend virus dat aan de membraan kan zijn gehecht los te maken, waarbij u voorzichtig bent om deze niet te beschadigen. Verwijder een deel van de overtollige lucht in de dialysecassette om het losmaakproces te vergemakkelijken.
   8. Voeg dit wassel samen met het virus dat zich reeds in de conische buis van 50 ml bevindt.
      OPMERKING: Het virus bevindt zich nu in 5% sucrose en is klaar om te worden verdeeld in 20 µL, 50 µL, 100 µL, of 200 µL aliquoten en bewaard bij -80 °CAlternatief kan NDV voor langdurige bewaring worden gelyofiliseerd en bewaard bij 4 °C zoals beschreven in sectie 2.6.

Resultaten

Figuur 1: Infectie en oogsten van NDV uit gespecificeerde pathogeenvrije geembryoniseerde kippeneieren. (A) Webachtige vaatstructuren (pijlen) moeten zichtbaar zijn na 9 dagen incubatie, naast beweging van het embryo. 'X' geeft de interface aan tussen het chorioallantoïsche membraan en de luchtkamer, en de plek waar het gat gemaakt moet worden voor inoculatie van het ei. (B) Afbeelding die een dood embryo weergeeft. Let op de afwezigheid van webachtige vaatstructuren. Ook zal een gebrek aan beweging van het embryo worden waargenomen. (C) Diagram van de componenten van een geembryoniseerd kippenei waarop de locaties van de luchtkamer, dooierzak, vruchtzak, chorioallantoïsche membraan en allantoïsvloeistof worden getoond. (D) Verwijdering van de schaal om het chorioallantoïsche membraan bloot te leggen. (E) Illustreert hoe de allantoïsvloeistof en het embryo eruit moeten zien na het openen van het chorioallantoïsche membraan. Afkorting: NDV = Newcastle disease virus.

Figuur 2: Schema waarin de algemene opstelling van het apparaat voor dieptefiltratie wordt weergegeven. Zorg ervoor dat de manometer stroomopwaarts van het dieptefilter is geïnstalleerd.

Figuur 3: Opstelling voor tangentiale flowfiltratie in verschillende configuraties. De pijlen geven de richting van de vloeistofstroom aan. (A) Illustratie van hoe de TFF-cassette wordt geassembleerd. (B) Schema van het TFF-systeem in de open configuratie die wordt gebruikt tijdens de zuivering en concentratie van de vloeistof. (C) Schema van de TFF-opstelling wanneer vloeistof uit het systeem wordt geëlueerd, zoals gebruikt tijdens de elutie van het virus en de reinigingsoplossing. (D) Schema van het TFF-systeem in de gesloten configuratie, die wordt gebruikt tijdens het reinigen van het TFF-systeem. Afkorting: TFF = Tangential flow filtration.

Figuur 4: Dichtheidsgradiënt-ultracentrifugatie en dialyse van geconcentreerd virus uit TFF. (A) Schema dat de samenstelling van de iodixanol-dichtheidsgradiënt weergeeft. (B) Bandingspatroon van het virus na ultracentrifugatie van het virus dat tijdens het zuiveringsproces met behulp van de ML-buffer is geproduceerd. De belangrijkste virusbevattende band is aangeduid met een zwarte ovaal. (C) Typische afmeting van een dialyse所述cassette geladen met 10 mL virus, voorbereid via een iodixanol-gradiënt aan het einde van de dialyseprocedure. Afkorting: TFF = Tangential flow filtration; ML = Mannitol-Lysine.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 mL spuit met slip-tip	BD	309659
10 mL Luer-Lok spuit	BD	302995
10% povidonjodiumoplossing	LORIS	109-08
15 mL conische buizen	Thermo-Fisher	14955240
18G x 1 1/2 inch stompe vulnaald	BD	305180
18G x 1 1/2 inch Precision Glide-naald	BD	305196
25 G x 5/8 inch naald	BD	305122
5 mL Luer-Lok spuit	BD	309646
Azijnzuur, geconcentreerd	Thermo-Fisher	A38-212
Agarose	Froggabio	A87-50G
Alexa-Fluor 48 geit-anti-muis	Invitrogen	A1001
Allegra X-14 Centrifuge	Beckman Coulter	B0861
ammoniumpersulfaat	BioRad	161-0700
Bleekmiddel (5%)	Thermo-Fisher	36-102-0599
Brede, niet-gekartelde pincetpunten	Thermo-Fisher	09-753-50
broomfenolblauw	Sigma-Aldrich	1405-25G
Centramate cassettehouder	PALL	CM018V
ChemiDoc XRS+	BioRad	1708265
Digitale 1502 Sportsman eibroeder	Berry Hill	1502W
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125-50G
Eierdoorlichter	Berry Hill	A46
Ethanol (70%)	Thermo-Fisher	BP82031GAL
Binnengeschroefde T-stukken, nylon, 1/8 inch NPT(F)	Cole-Parmer	06349-50
Vochtigheidskit	Berry Hill	3030
Iodixanol	Sigma-Aldrich	D156	60% (w/v) oplossing van iodixanol in water (steriel)
L-lysine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	62929-10G-F
Mannelijke en vrouwelijke Luer-Lok en 1/8 inch national pipe thread, NPT	Cole-Parmer	41507-44
Masterflex L/S digitale aandrijfunit	Cole-Parmer	RK-0752-20	Peristaltische pomp met digitaal display
Masterflex L/S Easy Load pompkop voor precisieslangen	Cole-Parmer	RK-07514-10
Masterflex siliconen slang (platina) L/S 16	Cole-Parmer	96420-16	BioPharm platuumsgehard siliconen
Omega Membrane LV Centramate Cassette, 10K	PALL	OS10T02
Optima XE-90 ultracentrifuge	Beckman Coulter	A9471
PBS 10X-oplossing	Thermo-Fisher	BP39-20
Poly(ethyleenglycol) gemiddelde Mn 20.00	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Slide-a-lyzer dialysekassette (Extra Strength), 10.00 MWCO 0,5-3 mL	Thermo-Fisher	66380
Natriumhydroxide (korrels)	Thermo-Fisher	S318-10
Specifiek pathogenenvrije eieren	CFIA	N.V.t.	De leverancier zal variëren afhankelijk van de locatie
Sucrose	Thermo-Fisher	S5-3
Supracap 50 dieptefilter	PALL	SC050V10P
Chirurgische scharen	Thermo-Fisher	08-951-5
Sw41Ti-rotor	Beckman Coulter	331362	Gebruikt in protocolstap 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7
SX4750-rotor	Beckman Coulter	369702
SxX4750 Adapter voor buizen met kegelvormige bodem	Beckman Coulter	359472
Dunwandige Ultraclear centrifugebuizen (9/16 inch x 3 1/2 inch)	Beckman Coulter	344059
Schroefklem voor slang	PALL	88216
Hulpmiddelmanometers	Cole-Parmer	68355-06