Sendai-virus-gemedieerde herprogrammering van menselijke bloedcellen tot geïnduceerde pluripotente stamcellen

Samenvatting

Bron: Rim, Y. A., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016).

Deze video demonstreert de generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) uit mononucleaire cellen van menselijk perifeer bloed met behulp van Sendai-virus-gemedieerde herprogrammering. De virale transcriptiefactoren activeren pluripotentienetwerken en onderdrukken lineage-genen, waardoor een subset van de cellen adhesie-eigenschappen verkrijgt en iPSC-kolonies vormt. Het protocol verrijkt en onderhoudt deze hergeprogrammeerde cellen via selectieve matrixbinding en dagelijkse vernieuwing van het medium.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot de monstername zijn uitgevoerd in overeenstemming met de IRB-richtlijnen van het instituut.

1. Transductie met Sendai-virus

1. Transductie (Dag 0)
   1. Verzamel de bloedcellen, breng ze over naar een conische buis van 15 ml en tel ze met een hemocytometer.
   2. Bereid 3 x 10⁵ cellen per transductie voor en centrifugeer de cellen bij 515 x g gedurende 5 min bij RT (kamertemperatuur).
   3. Verwijder het supernatant door opzuiging en resuspendeer de cellen in 0,5 ml bloedcelmedium.
   4. Breng de cellen over naar een putje van een niet-gecoate 24-wells plaat.
   5. Ontdooi het Sendai-virusmengsel op ijs en voeg dit toe aan de gesuspendeerde cellen. Voeg het Sendai-virus toe aan de cellen volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
   6. Sluit de plaat af met een sealfilm en centrifugeer deze bij 1.150 x g gedurende 30 min bij 30 °C.
   7. Incubeer de cellen na centrifugatie gedurende de nacht (O/N) bij 37 °C in 5% CO₂ .
2. Celoverdracht naar feeder-matrix (Dag 1)
   1. Coat de volgende dag een 24-wells plaat met vitronectine. Verdun de vitronectine-oplossing in PBS tot een eindconcentratie van 5 µg/ml. Voeg 1 ml vitronectine toe aan een putje van een 24-wells plaat en incubeer dit bij RT gedurende ten minste 1 uur. Verwijder de coating-oplossing voor gebruik. Gecoate platen kunnen gedurende 3 dagen bij RT worden bewaard.
   2. Breng al het medium dat de cellen en het virus bevat over naar het gecoate putje.
   3. Verzamel de resterende cellen met een extra 0,5 ml vers bloedcelmedium en voeg dit toe aan het putje met de cellen.
   4. Centrifugeer de plaat bij 1.150 x g gedurende 10 min bij 35 °C.
   5. Verwijder na centrifugatie het supernatant, voeg 1 ml iPSC-medium toe en houd de cellen O/N bij 37 °C in 5% CO₂.
3. Tweede celoverdracht (Dag 2)
   1. Coat de putjes van een nieuwe 24-wells plaat met 5 µg/ml vitronectine, zoals beschreven in stap 1.2.1. Gebruik één putje van de plaat per transductie.
   2. Breng de celsuspensie van de eerste plaat over naar de nieuw gecoate vitronectine-plaat.
      OPMERKING: Indien niet nodig, kunnen de suspensiecellen worden weggegooid. De procedure beschreven in stap 2.3 kan 2-3 keer worden herhaald met de suspensiecellen. Indien de stappen worden herhaald, oogst dan de cellen.
   3. Voeg ondertussen 1 ml iPSC-medium (geïnduceerde pluripotente stamcellen) toe aan het putje van de eerste plaat voor onderhoud, en incubeer dit O/N bij 37 °C in 5% CO₂.
   4. Houd de aangehechte cellen bij 37 °C en 5% CO₂ en voer dagelijks een mediumverversing uit met vers iPSC-medium. Kolonies zullen verschijnen op dag 14-21 na transductie.
   5. Centrifugeer de nieuw gecoate plaat met de suspensiecellen bij 1.150 x g en 35 °C gedurende 10 min.
   6. Incubeer de cellen na centrifugatie O/N bij 37 °C in 5% CO₂.
   7. Verwijder de volgende dag het supernatant en vervang dit door vers iPSC-medium.
      OPMERKING: De procedure beschreven in stap 1.3 kan 2-3 keer worden herhaald met de suspensiecellen. Indien de stappen worden herhaald, oogst dan de cellen in het supernatant en herhaal stap 1.3.
   8. Houd de aangehechte cellen in stand met dagelijkse mediumverversingen totdat een confluentie van 80% is bereikt.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Plasticware
conische buis van 50 ml	SPL	50050
15-ml conische buis	SPL	50015
10 ml wegwerppipet	Falcon	7551
5 ml wegwerppipet	Falcon	7543
24-wells plaat	TPP	92012
24-wellsplaat	TPP	92024
Materialen voor de generatie en kweek van iPSC's
CytoTune-iPSC Sendai Reprogrammeringskit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8-medium	STEMCELL Technologies	5940	iPSC-medium
Vitronectine	Life Technologies	A14700
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Kolonielosmakingsoplossing