1. Assay voor aanhechting/internalisatie
OPMERKING: Zorg ervoor dat alle reagentia zijn voorbereid voordat u met de assay begint. Voor de drie controlegroepen die in de resultaten sectie worden gepresenteerd (mock-geïnfecteerde cellen, neuraminidase-voorbehandelde cellen en met natriumazide behandelde cellen) zijn kleine wijzigingen in het protocol vereist.
- Bereid 16 deepwell-buisjes voor die elk 20.0 A549-cellen bevatten. Naast de experimentele set bestaande uit 4 buisjes zijn er 3 controlecondities, elk met 4 buisjes: mock-geïnfecteerde cellen, neuraminidase (NA)-voorbehandelde cellen en natriumazide-behandelde cellen. Elke groep bestaat uit 4 buisjes gelabeld als '0 min', '0 min + streptavidine (STV)', '30 min' en '30 min + STV'.
- Centrifugeer de buisjes 3 min bij 450 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 20 µl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Centrifugeer de buisjes bij 4 °C bij 450 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 20 µl Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) bevattende 0,3% runderalbumine (BSA), 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonzuur (HEPES) en 1% penicilline-streptomycine (incubatiemedium). Incubeer 30 min bij 37 °C.
OPMERKING: Voor de neuraminidasecontrole: Gebruik bacteriële neuraminidase (bijv. sialidase van Vibrio cholera) in een concentratie van 20 mU/ml verdund in incubatiemedium om de cellen te resuspenderen. - Centrifugeer de buisjes 3 min bij 450 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 20 µl PBS. Herhaal deze stap nogmaals en koel de buisjes vervolgens 10 min op ijs af.
- Centrifugeer de buisjes 3 min bij 450 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 10 µl gebiotineerd virus (gebruik de virusconcentratie zoals bepaald in sectie 2, verdund in infectie-PBS). Incubeer 1 uur op ijs.
- Centrifugeer de buisjes 3 min bij 450 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 20 µl PBS. Herhaal deze stap nogmaals.
OPMERKING: Voor de mock-geïnfecteerde controle: Gebruik infectie-PBS zonder virus. Voor de natriumazidecontrole: Gebruik virus verdund in infectie-PBS aangevuld met 0,1 % natriumazide. - Verwerking van de monsters na de infectie op ijs:
- Volg voor de '0 min'-monsters stap 2.5 en bewaar de monsters bij 4 °C totdat de overige monsters zijn gefixeerd.
- Centrifugeer voor de '0 min + STV'-monsters de buisjes 3 min bij 450 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets in 50 µl STV (gebruik de concentratie zoals bepaald in sectie 3) verdund in PBS bevattende 2% BSA en 0,1% natriumazide (om internalisatie tijdens het verwerken van het monster te voorkomen). Incubeer 30 min op ijs.
- Centrifugeer de buisjes 3 min bij 450 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 20 µl PBS. Herhaal deze stap nogmaals.
- Centrifugeer de buisjes voor fixatie 3 min bij 450 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 10 µl 3,7% paraformaldehyde (PFA). Incubeer 10 min bij RT. Herhaal daarna de wasstap zoals beschreven in 1.6) en bewaar de monsters bij 4 °C.
- Centrifugeer voor de '30 min'-monsters de buisjes 3 min bij 450 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 20 µl PBS bevattende 2% BSA. Incubeer 30 min bij 37 °C. Volg stappen 1.7.3-1.7.4 en bewaar de monsters bij 4 °C.
OPMERKING: Voor de natriumazidecontrole: Gebruik PBS aangevuld met 2 % BSA en 0,1 % natriumazide voor de incubatie van 30 min bij 37 °C. - Centrifugeer voor de '30 min + STV'-monsters de buisjes 3 min bij 450 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 20 µl PBS bevattende 2% BSA. Incubeer 30 min bij 37 °C. Centrifugeer daarna de buisjes 3 min bij 450 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets in 50 µl STV (gebruik de concentratie zoals bepaald in sectie 3) verdund in PBS bevattende 2% BSA en 0,1% natriumazide (om internalisatie tijdens het verwerken van het monster te voorkomen). Incubeer 30 min op ijs. Volg stappen 1.7.3-1.7.4 en bewaar de monsters bij 4 °C.
OPMERKING: Voor de natriumazidecontrole: Gebruik PBS aangevuld met 2 % BSA en 0,1 % natriumazide voor de incubatie van 30 min bij 37 °C.
- Centrifugeer de buisjes voor permeabilisatie 3 min bij 450 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 10 µl PBS bevattende 0,5% Triton X-10. Incubeer 6 min bij RT. Herhaal daarna de wasstap zoals beschreven in 1.6).
- Centrifugeer de buisjes 3 min bij 450 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 50 µl 2% BSA verdund in PBS bevattende STV-Cy3. (Let op: de juiste concentratie STV-Cy3 moet vóór aanvang van het experiment worden bepaald. Begin met een concentratie van 1:20 en test 2-voudige verdunningen tot 1:2.40. In onze praktijk bleek een verdunning van 1:1.00 optimaal te zijn.)
- Incubeer 1 uur in het donker bij RT. Herhaal daarna de wasstap zoals beschreven in 1.6, maar resuspendeer het pellet in 20 µl 2% BSA verdund in PBS.
- Analyseer de monsters via flowcytometrie. Bepaal het percentage Cy3-positieve cellen in elk monster.
