Beoordeling van faag-gemedieerde remming van bacteriële groei met behulp van optische dichtheidsmetingen

Samenvatting

Bron: Niu, Y. D., et al. Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings. J. Vis. Exp. (2021)

Deze video demonstreert een op microplaten gebaseerde assay om de lytische activiteit van faagcocktails tegen E.coli bacterieculturen te evalueren. Er wordt toegelicht hoe veranderingen in de optische dichtheid de potentie van de fagen en de concentratie onthullen die nodig is voor volledige bacteriële inhibitie

Protocol

1. Bereiding van buffer en reagentia

1. Maak 500 mL tryptic soy broth (TSB) (15 g TSB-poeder en 500 mL ultrapuur water) en autoclaveer dit.
   OPMERKING: Dit kan tot 3 maanden bij kamertemperatuur of tot 6 maanden bij 4 °C worden bewaard.
2. Maak 500 mL tryptic soy agar (TSA) (20 g TSA-poeder en 500 mL ultrapuur water) en autoclaveer dit.
   OPMERKING: Dit kan tot 3 maanden bij 4 °C worden bewaard.
3. Maak 500 mL Phosphate Buffered Saline (PBS; 4 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,77 g Na₂HPO₄ en 0,12 g KH₂PO₄, 500 mL ultrapuur water), meet en stel de pH in op 7,2 ± 0,2 bij 25 °C en autoclaveer dit.
   OPMERKING: Dit kan tot 6 maanden bij 4 °C worden bewaard.
4. Maak 200 mL 1 M MgSO₄ (49,294 g en 200 mL ultrapuur water) en steriliseer dit via een 0,22 µm polyethersulfonefilter.
5. Maak 500 mL TSB met 10 mM MgSO₄ (mTSB; 15 g TSB-poeder, 500 mL ultrapuur water en 5 mL 1 M MgSO₄) en autoclaveer dit; laat het geautoclaveerde medium afkoelen tot kamertemperatuur. Pas aseptische technieken toe. Breng met een serologische pipet voorzichtig 5,0 mL 1 M MgSO₄ over; draai voorzichtig om te mengen.

2. Voorbereiding van de bacteriële cultuur

1. Om de Bacterial Research Laboratory Culture (BRLC) voor te bereiden, haalt u de glycerolstockbuisjes uit de vriezer en brengt u deze over naar het laboratorium.
2. Gebruik een wegwerpopzaai-lus of een equivalent, dip deze in het buisje, neem een beetje inoculum (bevroren brij) op en strijk dit uit op een TSA-plaat of een equivalent in een biologische veiligheidskabinet klasse II. Incubeer de plaat bij 37 ± 2 °C gedurende 15−18 h.
3. Verpak de bereide BRLC-platen in zakken en bewaar deze bij 4 °C.
   OPMERKING: Algemene vervaldatum voor BRLC: 14 dagen bij 4 °C na bereiding.
4. Inoculeer een enkele kolonie van elke E. coli O157-stam van de te testen BRLC-platen in 10 mL TSB en incubeer deze statisch bij 37 °C gedurende 18 h om 9 log10 CFU/mL te bereiken.
5. Bereid de volgende ochtend een seriële verdunning van de overnight-culturen van elke E. coli O157-stam met mTSB bevattend 10 mM MgSO₄ om 4-5 log10 CFU/ml (of een ander gewenst inoculumniveau) te bereiken.
6. Meng een gelijk volume van een overnight-cultuur van elke stam om in totaal 4-5 log10 CFU/mL (of naar wens) te bereiken voor de bereiding van het bacteriële mengsel.
7. Plaats de verdunde bacteriële cultuur onmiddellijk bij 4 °C tot gebruik.
8. Verdun de inoculumcultuur 10- of 100-voudig en plaat 0,1 mL aliquoten van deze verdunningen op TSA-platen om geïsoleerde kolonies te verkrijgen.

3. Bereiding van fagentwerkoplossingen

1. Kweek werkvoorraden met een hoge titer (≥108 PFU/mL) voor elke faag die gescreend moet worden, volgens de standaardmethoden4.
   OPMERKING: De algemene houdbaarheidsperiode voor de faagvoorraden is 3 maanden in een plastic fles bij 4 °C na productie.
2. Om de gewenste titer te bereiken, bijvoorbeeld ~10⁸ PFU/mL voor lysiskinetiek, worden individuele faagpreparaten verdund met mTSB dat 10 mM MgSO₄ bevat. Stel faagcocktails samen door gelijke volumes van elke werkvoorraad met dezelfde titer te mengen in alle mogelijke combinaties.

4. Voorbereiding van de in-vitro lysekinetiek voor individuele fagen en fagen-cocktails

1. Bereid seriële 10-voudige verdunningen van elke faag voor in kolommen 1-8 in steriele 96-wells microplaten om de microplaat-assay op te zetten.
   OPMERKING: Vier fagen tegen één bacteriële stam kunnen in duplo worden getest, in aangrenzende kolommen, op elke plaat. De resterende vier kolommen zijn voor controles, die zonder faag zijn, evenals de mTSB-blank (Figuur 1).
2. Plaats 180 µL mTSB in de wells van kolommen 1 tot 12 van de 96-wells microplaat.
3. Voeg 20 µL verdunde individuele fagen of faagcocktails (~108 PFU/mL) toe aan wells 1-8 van de bovenste rij van de microplaat (Rij A).
4. Voeg voor de faagvrije controle en de blank-controle 20 µL mTSB toe aan de bovenste well van kolommen 9, 10 en 11.
5. Verdun de plaat met een 12-kanaals pipet. Transfer 20 µL van rij naar rij. Meng de inhoud goed door voorzichtig herhaaldelijk op te zuigen en uit te stoten (minstens vijf keer), en vervang de tips tussen de verdunningen. Verwijder 20 µL uit de laatste rij (Rij H).
   OPMERKING: Het gebruik van tips met filters wordt aanbevolen om kruiscontaminatie te voorkomen.
6. Stel een reservoir in voor elke stam. Gebruik een 1 mL pipet om 2-3 mL van de verdunde cultuur in het reservoir over te brengen. Gebruik voor kolommen 1-10 een multichannel pipet om 20 µL van de verdunde bacteriële cultuur aan elke well toe te voegen. Vervang de tips tussen elke toevoeging.
7. Dek de microplaat af en incubeer deze onder de gewenste condities (bijv. 37 °C gedurende 10 u of 22 °C gedurende 22 u).
8. Verwijder de microplaten na 2 u of andere gewenste intervallen uit de incubator.

Resultaten

Figuur 1: Voorgestelde indeling van de assay in een 96-well microplaat. Seriële 10-voudige verdunningen van elke faag worden voorbereid in kolommen 1-8 van steriele 96-well microplaten. Vier fagen tegen één bacteriële stam kunnen in dubbeltoets, in aangrenzende kolommen, op elke plaat worden getest. De overige kolommen zijn bestemd voor controles.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Essentiële benodigdheden, reagentia en apparatuur
Magnesiumsulfaatheptahydraat	Sigma	1374361
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	METTLER TOLEDO	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+	METTLER TOLEDO	17014405
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+	METTLER TOLEDO	17013808
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-20XLS+	METTLER TOLEDO	17014412
Pipette Tips RT LTS 1000µL FL 768A/8-low retention	METTLER TOLEDO	30389213
Pipette Tips SR LTS 20µL F 960A/5	METTLER TOLEDO	17005860
Reservoir	METTLER TOLEDO	89094-662
Steriele, transparante, 96-well vlakbodem polystyreen microplaten met deksels	Fisher	168055
Tryptic soy agar (TSA)	Sigma	105458-0500
Tryptic soy broth (TSB)	Sigma	105459-0500
T-vormige celspreaders	VWR	76299-566
Instrumenten
Compacte microbiologische incubatoren	Fisher	50125590H
Polygone roervissen	FIsher	14-512-125	lengte: 20 mm
Synergy Neo2 Hybrid Multi-Mode Reader	Fisher	BTNEO2M
Software
SAS	SAS Institute	9.4