Organotypische hippocampus Slice culturen

Samenvatting

We beschrijven een methode om organotypische hippocampale slices die gemakkelijk kan worden aangepast aan andere hersengebieden te bereiden. Brain plakjes worden gelegd op poreuze membranen en cultuur media is toegestaan ​​om een ​​interface te vormen. Deze methode behoudt de bruto-architectuur van de hippocampus voor maximaal 2 weken in cultuur.

Samenvatting

De hippocampus, een onderdeel van het limbisch systeem, speelt een belangrijke rol in het lange termijn geheugen en ruimtelijke navigatie ^1. Hippocampale neuronen kunt de kracht van hun verbindingen na korte periodes van sterke activering. Dit fenomeen, bekend als de lange termijn potentiatie (LTP) kan duren voor uren of dagen en is uitgegroeid tot de beste kandidaat mechanisme voor leren en geheugen ^2. Daarnaast is het goed gedefinieerde anatomie en de connectiviteit van de hippocampus ^drie maakten het tot een klassiek model systeem om synaptische transmissie en synaptische plasticiteit ⁴ te bestuderen.

Als ons begrip van de fysiologie van de hippocampus synapsen groeide en moleculaire spelers werd geïdentificeerd, een behoefte om synaptische proteïnen te manipuleren werd noodzakelijk. Organotypische hippocampus culturen bieden de mogelijkheid voor een eenvoudige genetische manipulatie en precies farmacologische interventie, maar behouden synaptische organisatie die is van cruciaal belang voor het begrijpen van synaps functioneren in een meer naturalistische context dan routine cultuur gedissocieerd neuronen methoden.

Hier presenteren wij een methode voor te bereiden en cultuur hippocampale slices die gemakkelijk kunnen worden aangepast aan andere hersengebieden. Deze methode maakt een eenvoudige toegang tot de plakjes voor genetische manipulatie met behulp van verschillende methoden zoals virale infectie ^5,6 of biolistics ^7. Daarnaast kunnen plakken eenvoudig worden teruggewonnen voor biochemische assays ^8, of overgedragen aan microscopen voor beeldvorming ⁹ of elektrofysiologische experimenten ^10.

Protocol

1. Voor het starten van de voorbereiding van de hippocampus Slices.

1. Bereid het weefsel slicer door het plaatsen van een stuk van Teflon plaat en montage van een nieuw blad.
2. Veeg de weefselkweek (TC) kap met 70% ethanol en stel het ontleden microscoop binnen. Steriliseer de motorkap, microscoop, weefsel snijmachine en alle instrumenten voor het ontleden van 15 minuten met UV-licht.
3. Bereid zes goed TC platen. Voeg 750 ul slice cultuur media (SCM) per goed en plaats celcultuur inserts in elk putje. Zorg ervoor dat de membranen worden grondig nat zonder bubbels eronder. Leg de platen in de broedstoof bij 35 ° C vergast met 5% CO ₂ totdat het nodig is.
4. Giet 50 mL lage Na ⁺ ACSF (ontleden oplossing) in een 100 ml beker en plaats het op ijs-zout mix. Bubble de lage Na ⁺ ACSF met 5% CO ₂ / 95% O ₂ tot de kleur verandert en ACSF vormt een brij mix van bevroren en vloeibare oplossing (10-20 min).
5. Hier krijg je een P5-P7 ratten pup. Maximaal drie pups worden gebruikt.

2. Hippocampus Slices Voorbereiding.

1. Snijd de kop van het dier met scherpe utility schaar. Snijd de huid en de schedel bloot te leggen. Open de schedel door het snijden van links naar rechts langs de interaurale lijn en dan langs de pijlnaad met een klein schaartje. Een optionele gesneden van links naar rechts in de voorkant kan worden gedaan om te bevorderen het verwijderen van de botten en de blootstelling van de hersenen. Schep uit de hersenen snel met een ronde lepel micro-spatel en plaats deze in de brij van ontleden oplossing om te relaxen voor ~ 1 minuut. Giet ~ 10 ml ijskoude ontleden oplossing op een 60 mm schaal en overdracht van de hersenen van de beker aan het gerecht. De hersenen moeten worden gedekt met ontleden oplossing.
2. Onder de microscoop ontleden: Plaats de hersenen en houd hem bij de middenlijn met het ontleden tang ingedrukt om de bodem van de 60 mm schaal. Gebruik de hippocampus ontleden instrument om de hemisferen weglaten van de middenhersenen te scheiden. De hippocampus worden dan blootgesteld op elk halfrond. Dan voorzichtig schep de hippocampus uit met de hippocampus ontleden tool. Gebruik het ontleden naald volledig isoleren van de hippocampus en het schoon zo veel mogelijk.
3. Met behulp van een geknipt tip van een P1000 filter pipettip voorzichtig zuigen de hippocampus en het overbrengen naar het Teflon vel op het weefsel snijmachine. Plaats de hippocampus op zijn concave kant.
4. Lijn de hippocampus loodrecht op het blad te coronale secties te verkrijgen en overmaat vloeistof uitlekken.
5. Snijd de hippocampus elke 400 micrometer.
6. Giet ~ 10 ml koud SCM in een 60 mm schaal en overdracht gesneden hippocampus van de snijmachine met een andere geknipt P1000 filtertip en koud SCM. Vermijd het maken van bubbels.
7. Met de hulp van een iris spatel en een rechte spatel voorzichtig los van de schijfjes van elkaar.
8. Aparte goed gedefinieerd en onbeschadigd plakjes van beschadigde schijfjes.

3. Hippocampus Slices Cultuur

1. Breng de zes-well platen met SCM en celkweek inserts uit de incubator. Met de hulp van een ander geknipt P1000 filtertip, transfer afzonderlijke segmenten op het membraan. Leg 4-5 plakjes per membraan. Wees voorzichtig niet te plaatsen de plakjes ofwel dicht bij het invoegen muur of dicht bij elkaar. Indien nodig, gebruik iris spatel te scheiden plakken. Verwijder overtollig medium. Touch plakjes zo weinig mogelijk als ze eenmaal op het membraan.
2. Verhuizen plaat terug naar incubator en cultuur bij 35 ° C en 5% CO _2.
3. Verandering SCM elke 48 uur in de TC kap door opzuigen van de SCM met een Pasteur pipet. Voeg 750 ul van verse voorverwarmde SCM per well. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden gevormd onder het membraan.

4. Oplossingen

1. Een lage Na ⁺ ACSF - Dissecting Oplossing voor slice culturen
   Om gedeïoniseerd en steriele H ₂ O toe te voegen:
   

   	Voor 500 ml	Voor 1000 ml	Uiteindelijke concentratie
   CaCl 2 (1 M)	0,5 ml	1 mL	1 mM
   D-Glucose	0,901 g	1,802 g	10 mM
   KCl	0,149 g	0,298 g	4 mM
   MgCl 2 (1 M)	2,5 ml	5 ml	5 mM
   NaHCO 3	1,092 g	2,184 g	26 mM
   Sucrose	40 g	80 g	234 mM
   Fenolroodoplossing 0,5% in DPBS	0,5 ml	1 mL	0,1% v / v

   
   Mix ~ 30 min
   Sterilize door passage door 0.22μm filter
   Maak 50 ml porties en bewaar bij 4 ° C niet langer dan 2 maanden.
2. Slice Cultuur Medium (SCM)
   

   	Voor 500 ml	Voor 1000 ml	Uiteindelijke concentratie
   MEM Eagle medium	4,2 g	8,4 g	8,4 g / l
   Paardenserum hitte geïnactiveerd	100 ml	200 ml	20%
   L-Glutamine (200 mm)	2,5 ml	5 ml	1 mM
   CaCl 2 (1 M)	0,5 ml	1 mL	1 mM
   MgSO 4 (1 M)	1 mL	2 mL	2 mM
   Insuline (1 mg / ml), opgelost in HCl 0,01 N	0,5 ml	1 mL	1 mg / l
   Ascorbinezuur, oplossing (25% w / v)	0,024 mL	0,048 mL	0,00125%
   D-Glucose	1.16g	2.32g	13 mM
   NaHCO 3	0.22g	0.44g	5.2 mM
   Hepes	3.58g	7.16g	30 mM

   
   Meng tot alles goed opgelost en breng aan de kamertemperatuur.
   Pas de pH op 7,27-7,28 met 1 N NaOH
   Meten osmolariteit. Aan te passen aan 320 mmol / kg met gedeïoniseerd en gesteriliseerd H ₂ O. Verwachten dat ongeveer 25 tot 40 ml toe te voegen. Controleer opnieuw osmolariteit.
   *** PH kan iets veranderen tijdens het instellen van osmolariteit, is dit ok is, is het belangrijker dat de osmolariteit is in de juiste range (317-323).
   Steriliseren passage door 0.22 urn filter.
   Maak 20 ml porties en op te slaan voor maximaal twee-drie weken bij 4 ° C.
   Gluatamine voorraad: voor te bereiden op een concentratie van 200 mM en bewaar bij -20 ° C in porties van 2,5 mL.
   Ascorbinezuur voorraad: voor te bereiden op een concentratie van 25% (w / v) en opgeslagen bij -20 ° C in fracties van 100 pi.

5. Representatieve resultaten:

Slices moet wit kijk onder een dissectie bereik zonder zwarte vlekken en goed gedefinieerd en onbeschadigd CA1, CA3, en de dentate gyrus regio's. Bacteriële besmetting is gemakkelijk te zien als het verplaatsen zwarte vlekjes op de middellange of troebelheid van het SCM. Bij plaatsing onder de microscoop, moet het oppervlak van het plakje schoon te kijken na 4 dagen in cultuur met een duidelijke en waarneembaar cellichamen. Als er geen duidelijke cellichamen worden gezien en nog veel puin beslaat de oppervlakte na 4 dagen, dan is geen gezonde slice.

Discussie

Deze methode is gebaseerd op de methode eerst beschreven door Stoppini et al.. ^Elf en biedt een snelle manier om de cultuur hippocampale slices. Het belangrijkste aspect van dit protocol is het handhaven van plakjes steriel, daarom is het van cruciaal belang voor geschikte steriele technieken te gebruiken en goed te desinfecteren en steriliseren van al het materiaal in contact met het weefsel.

Verschillende serums bronnen kunnen invloed hebben op de kwaliteit van de schij...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Celcultuur-inserts	EMD Millipore	PICM03050
6-wells platen	BD Biosciences	353046
Weefselsnijder	Stoelting Co.	51425/51415
Microscoop	Olympus Corporation	SZX7-ILLD2-100
Dissectie-instrument voor hippocampus	F.S.T.	10099-15
Grote gebruiksschaar. Perfection	F.S.T.	37500-00/37000-00 Rechts/ Linkshandig
Irisspatel	F.S.T.	10093-13
Rechte spatel	F.S.T.	10094-13
Afgeronde lepel-microspatel	VWR international	57949-039
Dissectienaald met enkele snijkant	Electron Microscopy Sciences	72946
Dissectiepincet	Dumont	#2
Kleine dissectieschaar	F.S.T.	14060-10
MEM Eagle medium	Cellgro	50-019 PB
Paardenserum hitte-geïnactiveerd	Invitrogen	26050-88
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081
CaCl2 (1 M)	Sigma-Aldrich	C3881
MgSO4 (1 M)	Sigma-Aldrich	M2773
Insuline (1 mg/ml), opgelost in HCl 0,01 N	Sigma-Aldrich	I0516
Ascorbinezuur, oplossing (25%)	Sigma-Aldrich	A4544
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Hepes	Sigma-Aldrich	H7523
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016
Fenolrood oplossing 0,5% in DPBS	Sigma-Aldrich	P0290
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
MgCl2 (1 M)	Sigma-Aldrich	M9272