Deze video demonstreert de infectie van zoogdiercellen in de stationaire fase met HSV-1 (Herpes Simplex Virus-1), gevolgd door replicatie van het virale genoom met behulp van de replicatiemachinerie van de gastheer en van het virus. Een synthetisch nucleoside-analoog wordt ingebouwd in nieuw gesynthetiseerd viraal DNA om replicerende genomen te labelen, die vervolgens worden geïsoleerd voor proteomische analyse van de geassocieerde gastheer- en virale eiwitten.
Methodenartikel
Labeling van replicerende HSV-1-genomen met een nucleoside-analoog
55 weergaven
⸱
31 augustus 2026
In dit artikel
Samenvatting
Protocol
1. Celkweek, virale infectie en EdC (5-ethynyl-2′-deoxycytidine)-markering (Figuur 1)
Het volgende protocol houdt in dat er met virussen wordt gewerkt. Raadpleeg de biosafety-protocollen van uw instelling met betrekking tot de veilige omgang met virussen en andere biologische agentia. Dit protocol is goedgekeurd door de Institutional Review Board van de University of Pittsburgh.
- Trypsiniseer een confluente weefkweekfles van 150 cm2 met MRC-5 (Medical Research Council cell strain 5) cellen en breng de cellen over naar een weefkweekplaat van 60 cm2 met 10 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) plus 10% FBS. Incubeer gedurende 3 - 4 dagen bij 37 °C in de aanwezigheid van 5% CO2 om confluentie en de stationaire fase te bereiken. Een confluente schaal van 60 cm2 bevat ~7 x 107 cellen. Bereid 1 plaat voor per conditie en 1 plaat voor elke bijbehorende negatieve controle.
OPMERKING: Cellen moeten de stationaire fase bereiken om cellulaire DNA-replicatie te remmen, zodat in volgende stappen alleen vDNA (viraal DNA) wordt gelabeld en gezuiverd.
OPMERKING: Elk monster vereist een bijbehorende ongelabelde negatieve controle, bereid onder dezelfde infectiecondities en op hetzelfde tijdstip, zonder toevoeging van EdC.
OPMERKING: Een op kleinere schaal uitgevoerde versie van dit experiment moet gelijktijdig worden uitgevoerd om de labeling van cellulair DNA via imaging te testen, met vergelijkbare celgroei, infectie, EdC-labelingcondities en tijdstippen (zie Stap 2). - Verdun 7 x 108 PFU (plaque-forming units) HSV-1 in 7 mL koude Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS). Verwijder het groeimedium en bewaar bij 37 °C. Om te infecteren, voegt u de 7 mL verdund virus toe aan de MRC-5 cellen en schudt u dit 1 uur lang bij kamertemperatuur. Verwijder na adsorptie het inoculum, spoel af met 50 mL TBS op kamertemperatuur en voeg het oorspronkelijke groeimedium weer toe. Incubeer bij 37 °C in de aanwezigheid van 5% CO2. Deze stap moet worden uitgevoerd voor elke experimentele conditie en negatieve controle.
OPMERKING: Verhoogde EdC-labeling kan worden bereikt met behulp van HSV-1 mutanten die defect zijn in de expressie van de virale dUTPase (UL50-gen) en/of uracilglycosylase (UL2-gen). HSV-1 dUTPase heeft een lage substraatspecificiteit en kan de activering van verschillende nucleosideanaloga verminderen. - Label virale genomen met EdC. Volg de instructies voor het labelen van binnenkomende genomen (1.3.1.), replicerende genomen (1.3.2.) of virale replicatievorken (1.3.3.).
OPMERKING: Alleen Stap 1.3.1, 1.3.2 of 1.3.3 moet worden uitgevoerd, afhankelijk van of er in volgende stappen respectievelijk binnenkomende genomen, gerepliceerde genomen of replicatievorken worden geanalyseerd.
OPMERKING: EdU of f-ara EdU kan in de plaats van EdC worden gebruikt. De toxiciteit van nucleosideanaloga moet worden gemonitord en geminimaliseerd.- Gebruik vooraf gelabelde stocks om de infectie in Stap 1.2 uit te voeren en ga binnen 4 uur na infectie (hpi) over naar Stap 2 of 3 om niet-gerepliceerd vDNA te onderzoeken (Figuur 1A).
OPMERKING: Bereid vooraf gelabelde virusstocks volgens het eerder beschreven protocol25. Virusstocks moeten door een G-25 kolom worden geleid om eventueel resterend EdC te verwijderen. - Label replicerend vDNA door 5 - 25 µM EdC gedurende 2 - 4 uur toe te voegen aan het celkweekmedium van geïnfecteerde cellen (Figuur 1B). Verdun EdC in 1 mL groeimedium voordat u het toevoegt.
- Om virale replicatievorken te labelen, voert u na het begin van vDNA-replicatie (≥4 hpi) een pulse-labeling uit van replicerend vDNA met 5 - 25 µM EdC gedurende 5-20 min. Voer vervolgens een chase uit door 3x te spoelen met chase-medium dat 25 - 10 µM 2´deoxycytidine (deoxyC) bevat, en incubeer daarna nogmaals 20-40 min in aanwezigheid van het chase-medium (Figuur 1C).
OPMERKING: Het pulse- en chase-medium moet voor gebruik worden geëquilibreerd op 37 °C en 5% CO2.
OPMERKING: Bij pulse-chase experimenten is het belangrijk rekening te houden met de tijd die nucleosiden nodig hebben om de cel binnen te treden en gefosforyleerd te worden voordat ze in het replicerende DNA kunnen worden ingebouwd. Dit moet empirisch worden bepaald.
OPMERKING: Om de resolutie van pulse-chase experimenten te bepalen, berekent u de virale replicatiesnelheid onder de gebruikte experimentele condities. Dit kan worden bepaald via kwantitatieve PCR van virale genomen tijdens een single-step growth tijdscursus.
- Gebruik vooraf gelabelde stocks om de infectie in Stap 1.2 uit te voeren en ga binnen 4 uur na infectie (hpi) over naar Stap 2 of 3 om niet-gerepliceerd vDNA te onderzoeken (Figuur 1A).
Resultaten
Figuur 1: Benaderingen voor het labelen van HSV-1 DNA. (A) Om de status van binnenkomend virus te analyseren, worden rustende MRC-5 cellen in G0 geïnfecteerd met vooraf gelabeld HSV-1 en worden genomen geanalyseerd bij minder dan 4 hpi om niet-gerepliceerd viraal DNA te bestuderen. (B) Om de status van gerepliceerd virus te analyseren, worden MRC-5 cellen geïnfecteerd met niet-gelabeld HSV-1 en wordt EdC (oranje sterren) toegevoegd aan het groeimedium van geïnfecteerde cellen, waarna deze gedurende 2 - 4 h worden geïncubeerd na het begin van de virale DNA-replicatie (≥4 hpi). (C) Om virale replicatievorken te analyseren, worden geïnfecteerde cellen gedurende 5-20 min gepulsgelabeld met EdC. Replicatievorken kunnen vervolgens worden nagevolgd (chase) met deoxyC. EdC-gelabeld DNA is oranje. Deze figuur is aangepast naar Dembowski en DeLuca
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| MRC-5-cellen | ATCC | CCL-171 | |
| Foetaal Runderserum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | Gesuppleerd met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (voor groei in flessen) of 30 mM (voor groei in schalen) natriumbicarbonaat |
| 60 cm²² weefkweekschaal | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS), pH 7,4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricine | ||
| HSV-1-stock | Voorraadoplossingen met titers hoger dan 1x109 PFU/mL werken het beste | ||
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T51307 | Los in DMSO om een 40 mM stockoplossing te bereiden, verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C |
| Celkweekincubator | |||
| Veiligheidskabinet | |||
| Warmteblokken | 65 °C en 95 °C |
