Isolatie van eiwitten uit viraal DNA-eiwitcomplexen

Samenvatting

Bron: Dembowski, J. A., et al. Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins. J. Vis. Exp. (2017).

Deze video demonstreert de isolatie van eiwit-viraal DNA-complexen uit celkernen met behulp van click-chemie en purificatie met magnetische beads. Het protocol omvat het labelen van virale genomen met alkyn-gemodificeerde nucleotiden, biotinylering via een click-reactie en binding aan streptavidine-gecoate magnetische beads. Na het wassen en hitte-elutie worden de gezuiverde complexen verzameld, snel ingevroren en bewaard voor verdere analyse.

Protocol

1. Zuivering van vDNA en geassocieerde eiwitten

OPMERKING: Alle buffers en reagentia moeten vóór gebruik op ijs worden gekoeld, en alle stappen moeten op ijs worden uitgevoerd, tenzij anders aangegeven.

1. Oogst de celkernen. OPMERKINGVoorafgaand aan de isolatie van kernen kan formaldehyde worden gebruikt om eiwitten aan DNA te crosslinken. Vervolgens kunnen strengere wascondities worden toegepast tijdens de DNA-zuivering op streptavidine-gecoate beads.
   1. Vervang het groeimedium door 20 mL kernextractiebuffer (NEB) en incubeer gedurende 20 min bij 4 °C met af en toe schudden. De kernen zullen zichtbaar worden onder de microscoop.
   2. Schraap de kernen van de plaat met een celschraper en breng deze over naar een conische buis van 50 mL. Centrifugeer 10 min lang bij 2.50 x g bij 4 °C verwijder het supernatant om de kernen te pelletiseren.
      OPMERKINGTrypanblauwkleuring kan worden gebruikt om de isolatie van kernen uit cellen te verifiëren.
   3. Los de nucleaire pellet voorzichtig op in 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), breng dit over naar een conische buis van 15 mL en pellet door middel van centrifugatie gedurende 10 min bij 2.500 x g bij 4 °CVerwijder de PBS volledig.
      OPMERKING: Kernen kunnen worden ingevroren en het protocol kan op dit punt worden onderbroken. Doe hiervoor het volgende: resuspendeer de kernpellet voorzichtig in een 500 µL vriesbuffer en incubeer de buis in een ethanol/droogijsbad. Bewaar de bevroren kernen bij -80 °COntdooi de kernen voor gebruik bij kamertemperatuur, breng ze snel over naar ijs, voeg 10 mL PBS toe, meng door zachtjes te schudden en pellet door middel van centrifugatie gedurende 10 min bij 2.500 x g bij 4 °Cen verwijder het PBS volledig. Het invriezen van kernen kan leiden tot een verminderde opbrengst.
2. Koppel biotin-azide covalent aan 5-ethynyl-2′-deoxycytidine (EdC)-gelabeld viraal DNA of vDNA.
   1. Resuspendeer het nucleaire pellet in 10 mL click-reactiemengsel [zie Tabel met materialen] door 5 keer voorzichtig op en neer te pipetteren met een 10 mL pipet.
      OPMERKINGHet is belangrijk dat de reagentia in het mengsel voor de clickreactie in de aangegeven volgorde worden toegevoegd.
   2. Roteer gedurende 1 uur bij 4 °CTerwijl u roteert, bereidt en koelt u buffers B1, B2 en B3 [zie Tabel met materialen].
   3. Pellet de kernen door 10 min lang te centrifugeren bij 2.50 x g bij 4 °CVerwijder het mengsel van de click-reactie volledig en was het pellet door het voorzichtig te resuspenderen in 10 mL PBS en 10 min lang te centrifugeren bij 2.50 x g bij 4 °C.
   4. Resuspendeer het nucleaire pellet voorzichtig in 1 mL PBS en breng dit over naar een microcentrifugebuis van 1,5 mL met behulp van een pipetteertip met een grote opening. Pelleteer de kernen door 10 min te centrifugeren bij 2.50 x g bij 4 °CVerwijder de PBS volledig en vries snel in met vloeibare stikstof.
      OPMERKINGHet protocol kan op dit punt worden onderbroken, en bevroren kernen kunnen worden bewaard bij -80 °CBevriezen-ontdooien helpt bij de daaropvolgende lyse; daarom wordt aanbevolen om de kernen flash-te bevriezen, zelfs wanneer stap 1.3 op dezelfde dag wordt uitgevoerd.
3. Lyseren van kernen en fragmenteren van DNA.
   1. Ontdooi de kernen op ijs en resuspendeer in 500 µL Meng Buffer B1 door herhaaldelijk te pipetteren. Incubeer 45 min op ijs.
   2. Sonicate de monsters 6 keer gedurende elk 30 s bij een amplitude van 40% met een microtip-probe van 3 mm. Plaats de monsters tussen de pulsen door 30 s op ijs. Na sonificatie moeten de monsters helder zijn en niet troebel.
      OPMERKINGDe sonicatiecondities moeten worden geoptimaliseerd voor individuele sonicators.
   3. Pelleteer celresten door te centrifugeren bij 14.0 x g gedurende 10 min bij 4 °CDe pelletgrootte moet aanzienlijk afnemen. Filtreer het supernatant door een 100 µM celzeef en behoud het doorstroomvolume.
   4. Voeg toe 500 µL Voeg Buffer B2 toe aan het gefiltreerde supernatant. 900 µL van dit monster wordt gebruikt in stap 1.4.2.
   5. Neem een aliquot van elke conditie voor DNA-isolatie (50 µL of 1/20ste volume) en voeg toe 50 µL 2x sodiumdodecylsulfaat (SDS)-bicarboplossing [zie Tabel van materialen]. Ga verder met het protocol voor DNA-isolatie.
   6. Neem een aliquot van elke conditie voor het input-eiwit (50 µL of 1/20ste volume) en voeg toe 50 µL 2x Laemmli-monsterbuffer, invriezen in vloeibare stikstof en bewaren bij -80 °C.
4. Bind het gebiotinyleerde DNA aan streptavidine-gecoate beads.
   1. Bereid Streptavidine T1-magnetische beads voor door het overbrengen van 300 µL van de bead-slurry in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Bereid voor elk monster één buis met beads voor. Was de beads 3x met 1 ml Buffer B2 door te vortexen om te resuspenderen, een magneet te gebruiken om de beads te scheiden en de wasbuffer af te zuigen.
      OPMERKINGGeoptimaliseerde bindingscondities resulteren in een maximale opbrengst en minimale achtergrondbinding. Experimenteel is vastgesteld dat Streptavidine T1-magnetische kraaltjes een aanzienlijk grotere bindingscapaciteit hebben dan agarosekraaltjes, alsook andere Streptavidinekraaltjes, en minder achtergrondbinding vertonen dan Streptavidine C1-kraaltjes (Figuur 1A).
   2. Voeg toe 900 µL van het monster uit stap 1.3.4. bij de gewassen beads voegen en een nacht lang roteren bij 4 °C.
      Opmerking: Vortex de beads niet zodra het monster aan hen is toegevoegd.
      OPMERKINGIndien er significante hoeveelheden DNA of eiwit worden geïsoleerd in de ongelabelde negatieve controle, kan deze stap worden verkort van een overnachting naar 4 uur om aspecifieke binding te verminderen.
5. Was de beads en elueer het vDNA en de geassocieerde eiwitten.
   OPMERKINGHet wordt aanbevolen om voor de overige stappen filtertips te gebruiken.
   1. Plaats de monsters in een magnetisch microcentrifugebuisrek, verwijder het supernatant, resuspendeer voorzichtig in 1 mL Buffer B2 en roteer bij 4 °C gedurende 5 min.
   2. Herhaal stap 1.5.1 drie keer.
   3. Plaats de monsters in een rek voor magnetische microcentrifugebuisjes, verwijder het supernatant, resuspendeer voorzichtig in 1 mL Buffer B3 en roteer bij 4 °C gedurende 5 min.
   4. Overdracht 100 µL voeg het kralenmengsel (1/10 deel van het volume) toe aan een nieuwe buis voor de isolatie van gebonden DNA. Plaats deze buis op de magneet, verwijder het supernatant en resuspendeer de kralen in 100 µL 1x natriumdodecylsulfaat- of SDS-bicarb-oplossing, en ga verder met het protocol voor DNA-isolatie.
   5. Breng de buis met het resterende deel aan 900 µL het kraalmengsel uit stap 1.5.3. naar de magneet brengen, het supernatant verwijderen en de kralen resuspenderen in 50 µL 2x Laemmli-monsterbuffer om eiwitten en DNA-eiwitcomplexen te elueren.
   6. Kook de monsters bij 95 °C gedurende 15 min, vortexen, kortly centrifugeren in de microcentrifuge en de magneet aanbrengen. Breng het eluaat over naar een nieuwe buis, vries het snel in en bewaar het bij -80 °C.
      OPMERKINGGebruik de dopjes om te voorkomen dat de buisjes openspringen tijdens het koken.
      OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd en de monsters kunnen worden bewaard bij -80 °C gedurende enkele weken.
   7. Analyseer eiwitmonsters via Coomassie Blue-kleuring, western blotting of massaspectrometrie volgens standaardprocedures. Representatieve resultaten worden getoond in Figuren 1 en 2.
      OPMERKINGOm vast te stellen of de eistopbrengst voldoende is voor massaspectrometrie, 7.5 µL van elk monster wordt gebruikt voor analyse via Coomassie Blue-kleuring en 7.5 µL voor western blotting van een representatief viraal genoom-geassocieerd eiwit (ICP4, ICP8 of UL42). Hetzelfde volume lysaten uit stap 1.3.6. wordt gelijktijdig geladen om de input-eiwitniveaus te controleren. De resterende monster(35 µL) wordt vervolgens geanalyseerd via massaspectrometrie.

Resultaten

Figuur 1: Representatieve resultaten van eiwitzuivering. (A) Vergelijking van de eiwitopbrengst wanneer zuiveringsstappen werden uitgevoerd met verschillende typen streptavidine-gecoate beads. Infectie werd uitgevoerd in aanwezigheid van EdC (+) om de eiwitopbrengst te vergelijken of in afwezigheid van EdC (-) om de achtergrondbinding te vergelijken. Infecties en EdC-labeling werden uitgevoerd, en DNA-eiwitcomplexen werden gezuiverd met vergelijkbare hoeveelheden van verschillende typen streptavidine-gecoate beads. Bovenste paneel: Vergelijking van de eiwitopbrengst na zuivering op streptavidine-gecoate agarose beads of Streptavidin M-280. Onderste paneel: Vergelijking van de eiwitopbrengst na zuivering op Streptavidin M-270, M-280, Streptavidin C1 of Streptavidin T1. Western blotting werd uitgevoerd met een antilichaam tegen het virale eiwit ICP4. Gezuiverd ICP4 is in de eerste baan getoond ter vergelijking. Een langere belichtingstijd van het onderste paneel was nodig om een soortgelijke intensiteit van ICP4 in baan 280 waar te nemen als in het bovenste paneel. (B) Representatieve resultaten van eiwitzuivering als functie van de tijd van EdC-labeling worden getoond. Infecties en EdC-labeling werden uitgevoerd, en DNA-eiwitcomplexen werden gezuiverd met Streptavidin T1 beads. EdC-labeling werd uitgevoerd gedurende 0, 20, 40 of 60 min, en de resultaten van Coomassie Blue-kleuring (boven) en western blotting (onder) worden getoond. Western blotting werd uitgevoerd met antilichamen specifiek voor ICP4, UL42 of GAPDH. Het eluaatmonster is afgenomen uit stap 1.5.5 en het lysaat uit stap 1.3.6. De pijl geeft streptavidine aan, terwijl L staat voor de eiwitladder.

Figuur 2: Voorbeelden van verschillende manieren om proteomica-gegevens te presenteren. (A) Cirkeldiagrammen vatten de eiwitten samen die zijn geïdentificeerd door massaspectrometrie van eiweleuaten geassocieerd met virale genomen gezuiverd bij 6 hpi. De waarden geven het aantal geïdentificeerde eiwitten voor elke functionele categorie aan. T geeft het totale aantal geïdentificeerde eiwitten aan. De kleuren geven de volgende categorieën aan: paars - RNA-verwerking, rood - transcriptie, groen - chromatineremodellering, oranje - DNA-replicatie, geel - nucleair transport, groenblauw - HSV-structurele eiwitten en grijs - overig/onbekend. (B) Venn-diagrammen tonen de overlap van eiwitten die geassocieerd zijn met virale genomen bij 6, 8 of 12 hpi. (C) Een STRING-kaart toont eiwitten die verrijkt zijn op virale replicatievorken na een EdC-puls van 5 minuten. Menselijke eiwitten die 5 keer sterker verrijkt zijn vergeleken met de ongelabelde negatieve controle worden getoond in de functionele interactiekaart, die is gegenereerd met STRING met gegevensinstellingen om alleen interacties met een hoge betrouwbaarheid weer te geven. Genamen zijn gebruikt om interacties in kaart te brengen. Cirkels geven eiwitten aan die functioneren in hetzelfde biologische proces.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
MRC-5-cellen	ATCC	CCL-171
Foetaal Runderserum (FBS)	Gibco	26140-179
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	12800-082	Gesuppleerd met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (voor groei in kolfjes) of 30 mM (voor groei in schaaltjes) natriumbicarbonaat
60 cm² kweekschaal	Thermo Fisher Scientific	166508
Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS), pH 7,4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricine
HSV-1 stock			Voorraden met titers hoger dan 1x10⁹ PFU/mL werken het best
Sephadex G-25 kolom (PD-10 ontziltingskolom)	GE Healthcare	17085101
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128-1
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC)	Sigma-Aldrich	T51307	Los op in DMSO om een 40 mM stockoplossing te bereiden, verdeel in aliquoten en bewaar bij -20 °C
2´-deoxycytidine (deoxyC)	Sigma-Aldrich	D3897	Los op in water om een 40 mM voorraadoplossing te bereiden, verdeel in aliquoten en bewaar bij -20 °C
Kernextractiebuffer (NEB)			Bereid een verse buffer voor (20 mM Hepes pH 7,2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 300 mM sucrose, 0,5% Igepal)
Celschraper	Bellco-glas	7731-22000	Autoclaveren voor gebruik
Trypanblauwoplossing	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7,2 (10x)			1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 18 mM KH₂PO₄ (voor gebruik verdunnen tot 1x in steriel water)
Kopers(II)sulfaatpentahydraat (CuSO₄·5H₂O)	Fisher Scientific	C489	Bereid een stockoplossing van 10 mM en bewaar deze op 4 °C gedurende maximaal 1 maand
(+) Natrium-L-ascorbaat	Sigma-Aldrich	A4034	Bereid een 10 mM voorraadoplossing vers en bewaar deze op ijs tot gebruik
Biotine-azide	Invitrogen	B10184	Bereid een 10 mM voorraadoplossing in DMSO, verdeel deze in aliquoten en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 1 jaar
Clickreactiemengsel			Bereid onmiddellijk voor gebruik door de reagentia in de aangegeven volgorde toe te voegen (10 mL: 8,8 mL 1x PBS, 20 µL 10 mM CuSO4)₄, 25 mL 10 mM biotinazide, 1 mL 10 mM natriumascorbaat)
Volledige protease-remmercocktail	Roche	11697498001	Los op in 1 mL water om een 50x-voorraadoplossing te bereiden; kan worden bewaard bij 4 °C gedurende maximaal 1 week, of voeg direct 1 tablet toe aan 50 mL buffer
Vriesbuffer			Bereid vers voor (7 mL 10% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease-inhibitor)
Buffer B1			Bereid vers voor (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease-remmer)
Buffer B2			Bereid verse (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5% Igepal, 1x protease-inhibitor) voor
Buffer B3			Bereid vers (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease-remmer)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer uitgerust met een microtip-sondeprobe van 3 mm	Sonics	VCX 130
Celzeef	Falcon	352360
Dynabeads MyOne Streptavidine T1	Life Technologies	65601
DynaMag-2 Magneet	Life Technologies	12321D
Mini-buisrotator	Fisher Scientific	260750F
2x Laemmli-monsterbuffer			Meng 40 mg SDS, 2 mL 100% glycerol, 1,25 mL 1 M Tris (pH 6,8) en 10 mg bromofenolblauw in 8 mL water. Bewaar bij 4 °C tot maximaal 6 maanden. Voeg voor gebruik 1 M DTT toe tot een eindconcentratie van 20 mM.
Dopsluitingen voor 1,5 mL buisjes	Fisher Scientific	NC9679153
Standaard reagentia voor western blotting
NOVEX Colloidal Blue Kleuringskit	Invitrogen	LC6025
weefkkweekplaat met 12 putjes	Corning	3513
Dekglasjes	Fisher Scientific	12-545-100	Autoclaveren voor gebruik
Microscoopglaasjes	Fisher Scientific	12-552-5
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Verdunnen tot 3,7% in 1x PBS voor gebruik
Runderserumalbumine (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	Bereid 3% in 1x PBS voor
Permeabilisatiebuffer (0,5% Triton-X 100)	Sigma-Aldrich	T8787	Bereid 0,5% Triton-X 10 in 1x PBS voor
Clickreactie-cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 48 Imaging Kit	Molecular Probes	C10337	Bereid voor volgens het protocol van de fabrikant
2x SDS-bicarb-oplossing			2% SDS, 20 mM NaHCO3₃
10x Tris-EDTA (TE), pH 8,0			10 mM Tris, 10 mM EDTA (verdunnen tot 1x voor gebruik)
Microcentrifuge voor 1,5 mL buisjes
Tafelcentrifuge voor 15 en 50 ml buizen
Celkweekincubator
Biologische veiligheidskast
Warmteblokken			65 °C en 95 °C