Cesiumchloride-gebaseerde zuivering van genoombevattende adenovirale vectoren

Samenvatting

Bron: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)

Deze video demonstreert de zuivering van high-capacity adenovirale vectoren met behulp van cesiumchloride-gradiënt ultracentrifugatie, waardoor de scheiding van genoombevattende virionen mogelijk wordt voor toepassingen in genoverdracht, vectorcharacterisering en preklinische therapeutische studies

Protocol

1. Zuivering en dialyse van HCAdV (high-capacity adenovirale vectoren)
   1. Om viraal lysaat voor cesiumchloride (CsCl)-gradiënten voor te bereiden, wordt de cel-virus-suspensie 4x bevroren in vloeibare stikstof en ontdooid in een waterbad bij 37 °C.
   2. Centrifugeer het virale lysaat bij 500 x g gedurende 8 min bij RT (kamertemperatuur) en verzamel het supernatant dat de HCAdV (high-capacity adenovirale vectoren) bevat.
   3. Bereid voor ultracentrifugatie CsCl-oplossingen als volgt voor. Weeg respectievelijk 37,5 g (voor 1,5 g/cm³), 33,5 g (voor 1,35 g/cm³) en 31,25 g (voor 1,25 g/cm³) CsCl-poeder af en vul aan met dH₂O tot 25 ml.
      1. Roer tot de oplossing helder wordt en filter de oplossingen steriel. Verwijder tot slot 1 ml van elke oplossing en weeg dit op een precisieweegschaal om te controleren of de dichtheid correct is. 1 ml moet respectievelijk 1,5 g, 1,35 g en 1,25 g wegen.
      2. Als de dichtheid te hoog is, kan deze worden aangepast door stapsgewijze toevoeging van kleine volumes (µl) steriele dH₂O. Meet na toevoeging van dH₂O de dichtheid opnieuw. Voeg indien nodig meer dH₂O toe.
      3. Herhaal de procedure tot de dichtheid correct is. Als de dichtheid te laag is, pas deze dan aan door een kleine hoeveelheid CsCl-poeder toe te voegen. Filter het opnieuw steriel en controleer de dichtheid. Als de dichtheid te hoog is, pas deze dan aan door dH₂O toe te voegen zoals eerder beschreven. Als de dichtheid nog steeds te laag is, voeg dan meer CsCl toe, filter het opnieuw steriel en controleer de dichtheid. Herhaal de procedure tot de dichtheid correct is.
   4. Bereid CsCl-stapgradiënten in 6 transparante ultracentrifugebuizen. Pipetteer de CsCl-oplossingen voorzichtig en langzaam in de buizen in de volgende volgorde: 0,5 ml 1,5 g/cm³ CsCl-oplossing, 3 ml 1,35 g/cm³ CsCl-oplossing en 3,5 ml 1,25 g/cm³ CsCl-oplossing (Figuur 1C).
   5. Breng ~4,5 ml van het geklaarde vectorsupernatant uit stap 1.2 aan bovenop de 1,25 g/cm³ CsCl-laag. Centrifugeer de gradiënten in een ultracentrifuge met een swing-out rotor (SW-41) bij 12 °C gedurende ten minste 2 uur bij 226.000 x g (35.000 rpm) met langzame versnelling en vertraging om HCAdV-genoombevattende virusdeeltjes te scheiden van lege deeltjes en celresten.
      OPMERKING: Onder optimale omstandigheden vormde zich bovenin de buizen een diffuse band van celresten. Daaronder kunnen twee witte banden worden waargenomen. De bovenste band bevat lege deeltjes, terwijl de onderste band gelijkstaat aan de HCAdV (Figuren 1C en 2A).
   6. Verwijder voorzichtig de lagen celresten en lege deeltjes, verzamel 1 ml van de onderste banden uit elke buis en overbreng het virus met een schone pipetpunt naar een steriele 50 ml buis. Voeg tot 24 ml 1,35 g/cm³ CsCl-oplossing toe aan de verzamelde virusdeeltjes en meng voorzichtig.
   7. Vul centrifugebuizen tot de rand met de 1,35 g/cm³ CsCl-virusoplossing en centrifugeer O/N (overnight) (18-20 u) bij 226.000 x g (35.000 rpm) bij 12 °C in een ultracentrifuge met een swing-out rotor (SW-41) met langzame versnelling en vertraging.
   8. Verzamel de HCAdV die aanwezig is in de prominente onderste band. Aangezien een potentiële bovenste band lege deeltjes bevat, worden de bovenste lagen met een pipet verwijderd (zie Figuren 1C en 2B). Neem vervolgens de onderste band af met een pipet.
   9. Dialyseer de verzamelde virusdeeltjes voor bufferuitwisseling.
      1. Snijd een strip dialysebuis (MWCO: 50.000) van ongeveer 8 cm lengte af en was deze 3x met steriele dH₂O. Sluit vervolgens één zijde van de dialysebuis met een plastic klem en overbreng het verzamelde virus uit stap 5.8 naar de buis met een 1-ml pipet. Vermijd luchtbellen in de buis en sluit deze aan de andere zijde met een plastic klem dialyseafsluiting.
      2. Dialyseer gedurende 2 uur bij 4 °C met langzaam roeren in 1 L dialysebuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10% glycerol en 1 mM MgCl₂ (magnesiumchloride) in gedeïoniseerd H₂O). Vervang de dialysebuffer door 2 L dialysebuffer en dialyseer O/N bij 4 °C met langzaam roeren. Gebruik alternatief een sucrosebuffer (140 mM NaCl (natriumchloride), 5 mM Na₂HPO₄.2H₂O (dinatriumwaterstoffosfaat), 1,5 mM KH₂PO₄ (kaliumdihydrogenfosfaat) en 730 mM sucrose, pH 7,8).
      3. Verzamel de gedialyseerde virusdeeltjes uit stap 1.9.2. met een 1 ml pipet. Bereid meerdere aliquoten van de gewenste kleine volumes (25-100 µl) en bewaar het gezuiverde virus bij -80 °C.

Resultaten

Figuur 1. Representatieve resultaten voor de kloningsprocedure en het vrijmaken van het HCAdV (High-capacity adenoviral vectors) genoom uit pAdVFTC. (A) Vrijmaken van de expressiecassette van het gen van belang (GOI) uit pHM5 door PI-SceI en I-CeuI digestie. (B) gezuiverde GOI-expressiecassette en gezuiverde, gedefosforyleerde pAdVFTC, respectievelijk gedigesteerd met PI-SceI and I-CeuI. (C) Analytische HincII digestie van pAdVFTC-klonen met en zonder GOI. (D) Vrijmaken van het HCAdV-genoom dat het GOI draagt uit pAdVFTC-GOI door NotI digestie

Figuur 2. Representatieve resultaten na cesiumchloride (CsCl) gradiëntcentrifugatie. (A) Na het uitvoeren van een stapsgewijze gradiënt (zie ook stap 1.5); (B) Na een continue gradiënt (zie ook stap 1.7).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ultra Clear ultracentrifugebuizen	Beckmann Coulter	344059	dichtheidsgradiëntcentrifugatie
Ultracentrifuge	Beckmann Coulter		dichtheidsgradiëntcentrifugatie
SW-41 rotor	Beckmann Coulter		dichtheidsgradiëntcentrifugatie
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane	VWR	132129	dialysebuisjes
Klaar voor gebruik dialysecassettes	Thermo	66383	dialyse
Cesiumchloride	Carl Roth	8627.1	dichtheidsgradiëntcentrifugatie
LB-medium	Carl Roth	X968.3	bacterieel groeimedium
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	dialysebuffer/ lysisbuffer
Glycerol 99.5%	Carl Roth	3783.1	dialysebuffer
MgCl₂ 98.5%	Carl Roth	KK36.2	dialysebuffer
NaCl	Carl Roth	3957.1	optionele dialysebuffer
KH₂PO₄	Carl Roth	3904.2	optionele dialysebuffer
Sucrose	Carl Roth	9286.1	optionele dialysebuffer
Na₂HPO₄·2H₂O	Carl Roth	4984.2	optionele dialysebuffer
1.5 ml buisjes	sarstedt	72,730,005	bewaring van viruspreparaten bij -80 °C