Virale transgene expressie in ventriculaire weefsels van knaagdieren OPMERKING: Bewaar recombinant adenovirus of adeno-geassocieerd virus (AAV) dat het doeleiwit tot expressie brengt, evenals het overeenkomstige controlevirus, zoals Ad-GFP (groen fluorescent eiwit) (titer van 1 x 10¹⁰ plaque-forming units [PFU]/ml) of AAV9-GFP (titer van 1 x 10¹³ genoomkopieën [GC]/ml) (zie Tabel met Materialen), in een vriezer op −80 °C. Ontdooi het virus op ijs op de dag van de virusinjectie. Zuig het virus dat het doeleiwit tot expressie brengt en het controlevirus op in twee afzonderlijke spuiten (volume = 50 µL) met 30 G ½ naalden en houd deze op ijs tot gebruik. OPMERKING: Eventuele luchtbellen in de spuit en naald moeten zorgvuldig worden verwijderd. Dien buprenorfine toe aan ratten of muizen (0,05 mg/kg voor ratten, 0,1 mg/kg voor muizen, subcutaan) en induceer een uur later anesthesie met 3% isofluraan; handhaaf isofluraan op 2% (in 100% zuurstof met een stroomsnelheid van 0,5-1,0 L/min) voor de daaropvolgende procedure. Knijp voorzichtig in het lichaam van het dier (bijv. de staart) met een pincet; indien het dier niet reageert op de knijpbeweging met lichaamsbewegingen, is de correcte anesthesie bevestigd. Handhaaf de lichaamstemperatuur op 37 °C met een elektrische warmtemat. Scheer het haar in de borststreek met een haartrimmer. OPMERKING: Bij het gebruik van een elektrische warmtemat moet voorzichtigheid in acht worden genomen vanwege de mogelijke ongelijkmatige warmteverdeling. Breng oogzalf aan in beide ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen. Plaats het dier in rugligging en gebruik een preklinisch beeldsysteem (zie Tabel met Materialen) voor echografische beeldvorming van het hart van het dier in de kort-as oriëntatie. OPMERKING: De volgende stappen worden uitgevoerd in een biosafety cabinet klasse II, wat een steriele omgeving biedt. Standaard veiligheidsprocedures, inclusief die voor de veilige omgang met naalden, worden toegepast. Steriliseer de linker onderborststreek van het dier door drie maal in een cirkelvormige beweging afwisselend een jodium- of chloorhexidine-gebaseerde scrub en alcohol aan te brengen. Breng onder echografische begeleiding de 30 G 1/2 naald van de spuit met het virus, zoals voorbereid in stap 1.1, via de linker onderborstzijde van het lichaam in de borstkas van het dier in. Benader met de naaldpunt de voorste vrije wand van het linker ventrikel en injecteer langzaam 10-15 μL van het virus. Verifieer de succesvolle injectie op echobeelden door de toegenomen helderheid nabij de naaldpunt. OPMERKING: De hoeveelheid virus die op elke plek wordt geïnjecteerd is maximaal 15 μL om fysieke schade aan de myocardweefsels te voorkomen. Trek de naald uit het hart en breng deze in andere regio's van het linker ventrikel in voor een tweede en derde injectie van dezelfde hoeveelheid virus. OPMERKING: Het totale aantal injectieplaatsen wordt bepaald door het experimentele ontwerp. Als focale transgene expressie vereist is, is slechts één injectie nodig; als een meer diffuse transgene expressie vereist is, zijn gewoonlijk meerdere injectieplaatsen (drie tot vijf) nodig. Keer het dier na voltooiing van de injecties terug naar de kooi. Houd het dier zorgvuldig in de gaten totdat het voldoende bewustzijn heeft teruggewonnen om in sternumligging te blijven, en breng het vervolgens terug naar de verblijfruimte. Dien de volgende 2 dagen buprenorfinehydrochloride toe aan het dier (0,1 mg/kg, tweemaal daags voor muizen, 0,05 mg/kg, tweemaal daags voor ratten, subcutaan). Plaats de dieren terug in het vivarium en controleer dagelijks op ongebruikelijke tekenen van pijn of stress; indien deze worden vastgesteld, dienen de dieren te worden behandeld volgens de protocollen van de institutionele commissie voor dierenzorg. Lu, A., et al. Virale transgene expressie in harten van knaagdieren en de beoordeling van het risico op hartritmestoornissen. J. Vis. Exp. (2022)
De video demonstreert een methode voor echogeleide intramyocardiale injectie van een recombinant viraal vector in een muismodel. Deze techniek maakt gerichte genoverdracht naar het hart mogelijk om de effecten van transgene expressie op de hartfunctie te bestuderen.
