Transductie van een gehumaniseerde rattenlever met behulp van adeno-geassocieerde virusvectoren

Samenvatting

Bron: Hiller, T., et al. Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2. J. Vis. Exp., (2016)

Deze video demonstreert genoverdracht via een adeno-geassocieerd virus in een gehumaniseerd ratleversteunweefsel. De vector brengt een transgen dat een fluorescerende reporter en gene-silencing RNA codeert over in levercellen via receptor-gemedieerde endocytose. Dit model ondersteunt efficiënte transductie in een geperfuseerd 3D-levertweefselsysteem.

Protocol

Transductie van het levermodel

1. Pas de adeno-geassocieerd virus (AAV) vectoroplossing aan tot een eindconcentratie van 2.7 x 10¹³ vectorgenomen in 5 ml door het bijbehorende volume fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe te voegen.
2. Koppel de lever los van het mediacircuit door de slang van de canule te verwijderen. Sluit een spuit van 5 ml aan op de canule van de poortader en injecteer de volledige AAV vectoroplossing (5 ml).
3. OPMERKING: Voeg optioneel fenolrood (5 µg/ml) toe om de distributie van de AAV vectoroplossing door de gehele lever te volgen.
4. Incubeer gedurende 1 hr zonder pompen. Verhoog de stroomsnelheid geleidelijk, beginnend met 1.25 ml/min gedurende 10 min; 2.5 ml/min gedurende 20 min en 3.75 ml/min gedurende 30 min. Cultiveer de recellulariseerde rattenlever gedurende 6 dagen.
5. OPMERKING: Vervang om de dag één derde van het medium door vers medium (50 ml). Neem monsters van het cultuurmedium om fysiologische parameters te meten, zoals de lactaatdehydrogenase-activiteit, de pH van mediummonsters en de concentratie van glucose en lactaat.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Incubator	Fraunhofer	/
Peristaltische pomp	Fraunhofer	/
Flens met groef	Duran	2439454
O-ring transparant	Duran	2922551
Snelspan klem	Duran	2907151
Platte flensdeksel	Duran	2429857
Schroefdraadbuis	Duran	2483802
Schroefdraadbuis	Duran	2483602
Siliconen afdichtingsring	Duran	2862012
Schroefdop	Duran	2924013
Schroefdop	Duran	2924008
Schroefdop met opening	Duran	2922709
Schroefdop met opening	Duran	2922705
Filter	Sarstedt	831,826,001
Siliconenslang	VWR	228-1500
Buisconnector	Ismatec	ISM556A
Biocompatibele slang	Ismatec	SC0736
T175 kweekflessen	Greiner bio-one	660 160
RPMI 1640	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0501-500
glutamine	BioWest SAS (Th. Geyer)	X0551-100
Trypsine	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0940-100
penicilline/streptomycine	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0022-100
foetaal kalfserum	cc pro	S-10-M
HepG2	DSMZ	ACC 180