1. Transductie van de recellulariseerde rattenlever Grootschalige productie van virale vectoren afgeleid van adeno-geassocieerde virussen (AAV-vector) AAV-vectoren produceren, zuiveren en kwantificeren: Produceer kortweg AAV-vectoren in roller bottles en zuiver deze door middel van iodixanol-gradiëntcentrifugatie. Verwijder resident iodixanol door filtratie over PD10-gelfiltratiekolommen. Bepaal de AAV-vectorconcentratie via kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), waarbij genomisch AAV-DNA als standaard wordt gebruikt. OPMERKING: De zelfcomplementaire, pseudotypische AAV2/6-vector die in de huidige studie is gebruikt, codeerde voor het smaragdgroene fluorescerende reportereiwit, EmGFP, als reporter om de transductie-efficiëntie aan te tonen, en een short hairpin RNA (shRNA)-expressiecassette voor de knockdown van een endogeen tot expressie gebracht gen (menselijke cyclofiline B (hCycB), Figuur 1). Zorg voor een voldoende hoeveelheid pseudotypische scAAV-vectoren van serotype 6 (2,7 x 10¹³ AAV-vectoren per levermodel). Transductie van het levermodel Stel de AAV-vectoroplossing in op een eindconcentratie van 2,7 x 10¹³ vectorgenomen in 5 ml door het betreffende volume fosfaatgebufferde saline (PBS) toe te voegen. Koppel de lever los van het mediacircuit door de slang van de canule te verwijderen. Verbind een spuit van 5 ml met de canule van de poortader en injecteer de volledige AAV-vectoroplossing (5 ml). OPMERKING: Optioneel kan fenolrood (5 µg/ml) worden toegevoegd om de distributie van de AAV-vectoroplossing door de lever te volgen. Incubeer gedurende 1 uur zonder pompen. Verhoog de stroomsnelheid geleidelijk, beginnend met 1,25 ml/min gedurende 10 min; 2,5 ml/min gedurende 20 min en 3,75 ml/min gedurende 30 min. Cultureer de recellulariseerde rattenlever gedurende 6 dagen. 2. Beoordeling van de recellulariseerde getransduceerde rattenlever Hematoxyline- en eosine (HE)-kleuring en immunohistochemische analyse Neem met een scalpel monsters (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) uit elke leverkwab. Incubeer de monsters gedurende 1,5 uur bij 4 °C in een oplossing van 4% paraformaldehyde (PFA) + 4% sucrose. (Waarschuwing: PFA is toxisch en carcinogeen. Houd PFA altijd in een zuurkast en draag passende beschermende kleding.) Was drie keer met PBS (1 min per wasstap) en incubeer overnacht bij 4 °C in 8% sucrose. Giet het fixatium in plastic cryomallen en plaats de monsters in het fixatium, vrij van luchtbellen. Voeg fixatium toe totdat het monster volledig is bedekt. Bewaar de ingebedde monsters bij -80 °C tot verder gebruik. Bereid cryosneden (10 µm) met een cryotoom. Beoordeel de recellularisatie via hematoxyline + eosine-kleuring. Beoordeel de transductie-efficiëntie via immunohistochemische kleuring voor het gen van interesse (hier: EmGFP). Hiller, T. et al. Studie van virale vectoren in een driedimensionaal levermodel dat is gerepopuleerd met de menselijke hepatocellulaire carcinoomcellijn HepG2. J. Vis. Exp. (2016)
Deze video demonstreert immunohistochemische kleuring om virale gentransfer in een gerecellulariseerd ratlevermodel te evalueren. Reporterexpressie, bevestigd door antilichaamdetectie en co-lokalisatie met kernkleuring, duidt op een succesvolle virale transductie in de cellen.
