Genereren van conditionele knockdown-cellen met behulp van een tetracycline-responsief lentiviraal shRNA-expressiesysteem

Samenvatting

Bron: Kubala, M. H. & DeClerck, Y. A. Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (2017)

Deze video demonstreert het genereren van conditionele knockdown-kankercellijnen met behulp van een Tet-induceerbaar lentiviraal shRNA-systeem. Er wordt een overzicht gegeven van de stappen voor virale transductie, antibioticaselectie en doxycycline-geïnduceerde gen-silencing.

Protocol

1. Genereren van stabiel getransduceerde cellijnen
   1. Zaai HCT116 colonkankercellen en MDA-MB-231 borstkankercellen uit bij 50.000 cellen/well in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (Pen/Strep) in een 12-wellplaat. Incubeer bij 37 °C bij 5% CO₂ totdat de cellen 60 - 70% confluent zijn.
   2. Was de cellen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), voeg 1 mL virushoudend medium toe aan de kankercellen en incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C bij 5% CO₂. Voeg als controle 1 mL vers DMEM-medium aangevuld met 10% FBS en 1% Pen/Strep toe aan 2 wells met kankercellen.
   3. Verwijder het virushoudende medium voorzichtig via aspiratie. Was de cellen met PBS en vervang het medium door DMEM met 10% (v/v) tetracycline-vrij (Tet-vrij) FBS en 1% Pen/Strep.
   4. Was de cellen na 72 h met PBS en vervang het medium door DMEM met 10% Tet-vrij FBS, 1% Pen/Strep en 1 µg/mL puromycine voor selectie van de virusgetransduceerde cellen.
      1. Pas, afhankelijk van de gebruikte cellijn, de puromycineconcentratie aan voor een optimale selectie door een reeks puromycineconcentraties (0,1, 0,5, 1, 2 en 5 µg/mL) te testen in niet-getransduceerde cellen en de laagste concentratie te kiezen waarbij geen controlecellen overleven na 3 dagen cultuur.
   5. Selecteer virusgetransduceerde cellen door de cellen 3 - 14 dagen te cultiveren in aanwezigheid van puromycine. Bereid als controle twee extra wells met niet-getransduceerde cellen, één met medium bevattende puromycine en één zonder puromycine. Observeer de gedeeltelijke uitschakeling van de cellen door puromycine in de well met virusgetransduceerde cellen in vergelijking met de controlewells.
      OPMERKING: Niet-getransduceerde cellen zullen niet groeien in aanwezigheid van puromycine.
   6. Verifieer de efficiëntie van de conditionele knockdown (KD) in de puromycineresistente HCT116 colonkanker- en MDA-MB-231 borstkankercellen.
      OPMERKING: De effectieve concentratie doxycycline varieert per gebruikte cellijn en moet worden getitreerd (doorgaans van 100 ng/mL tot 2 µg/mL).
      1. Bepaal de doxycyclineconcentratie die niet toxisch is voor de cellen, maar wel effectief is in het downreguleren van de expressie van het eiwit van belang. In dit protocol is 1 µg/mL succesvol in vitro gebruikt.
      2. Cultiveer de cellen 72 h in aanwezigheid en afwezigheid van 0,1, 1 en 2 µg/mL doxycycline. Verifieer het expressieniveau van het gedownreguleerde eiwit (hier plasminogeenactivatorremmer 1 (PAI-1)) in het cellysaat via Western blot-analyse. Vergelijk HCT116- en MDA-MB-231-cellen die conditioneel short hairpin RNA (shRNA) tot expressie brengen met scrambled controlecellen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tet-pLKO-puro lentivirale vector	Addgene	21915
FBS (Tetracycline-vrij)	Omega Scientific	FB-15
psPAX vector	Addgene	12260
pMD2.G vector	Addgene	12259
HEK293 cellen	ATCC	CRL-1573
PBS	Corning	21-031-CV
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)	Corning	21-031-CV
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonzuur (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
Puromycine	Sigma-Aldrich	P9620
Doxycycline hyclaat	Sigma-Aldrich	D9891-25g
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)	Corning	10-040-CV
Penicilline-Streptomycine	Gibco	15140122