Bereiding van een virusverrijkte suspensie middels stapsgewijze sucrosecentrifugatie

Samenvatting

Bron: Vijayraghavan, S. and Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp., (2017)

Deze video demonstreert een tweestaps ultracentrifugatiemethode met gebruik van sucrosegradiënten en -kussens om viruspartikels uit cellendruksupernatant te zuiveren en te concentreren. De procedure maakt scheiding op basis van drijvendheid mogelijk, waardoor intact virus kan worden teruggewonnen dat geschikt is voor downstream-applicaties.

Protocol

1. Concentratie van virale deeltjes door ultracentrifugatie

OPMERKING: We maken gebruik van een dubbele sucrose-zuiveringsmethode die uit twee stappen bestaat: een sucrosegradiëntstap en een sucrosekussenstap (Figuur 1).

1. Vul de conische ultracentrifugatiebuizen in de volgende volgorde om een sucrosegradiënt te creëren: 0,5 mL 70% sucrose (opgelost in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS]), 0,5 mL 60% sucrose (opgelost in DMEM), 1 mL 30% sucrose (opgelost in Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM]) en 2 mL 20% sucrose (opgelost in 1x PBS).
2. Voeg het virusbevattende supernatant voorzichtig toe aan de gradiënt. Aangezien het totale volume supernatant van vier platen van 15 cm 100 mL is, moeten zes ultracentrifugatiebuizen per run worden gebruikt om het volledige volume van het virussupernatant te verwerken.
   1. Elke ultracentrifugatiebuis die voor deze stap wordt gebruikt, heeft een volumeinhoud tot 30 mL (inclusief het volume sucrose). Verdeel het virale supernatant gelijkmatig over de buizen, waarbij minimaal 10% vrije ruimte wordt gelaten om morsen te voorkomen.
   2. Pas het cultuurvolume aan naar ~20 - 22 mL per plaat wanneer er meer dan vier platen van 15 cm per experiment worden gebruikt, zodat het uiteindelijke volume van het samengevoegde virale supernatant gemakkelijk in zes ultracentrifugatiebuizen past.
   3. Vul de ultracentrifugatiebuizen tot ten minste driekwart van hun totale volumeinhoud, anders kunnen de buizen tijdens de centrifugatie breken, wat kan leiden tot mogelijk verlies van monster en/of schade aan de apparatuur.
3. Balanceer de buizen met 1x PBS en centrifugeer de monsters bij 70.000 x g gedurende 2 u bij 17 °C
   OPMERKING: Om verstoring van de sucroselaag tijdens de acceleratie te voorkomen, moet de ultracentrifuge zo worden ingesteld dat de rotor tijdens de eerste 3 min van de run langzaam versnelt tot 200 rpm. Stel de ultracentrifuge op dezelfde manier zo in dat de rotor aan het einde van de run gedurende 3 min langzaam vertraagt van 200 rpm naar 0 rpm.
4. Verzamel voorzichtig de sucrosefracties van 30 - 60% in schone buizen (Figuur 1). Voeg koud 1x PBS toe aan de samengevoegde fracties en vul het volume aan tot 100 mL; meng door meerdere keren op en neer te pipetteren.
5. Ga over tot de sucrose-kussenstap door de virale preparatie voorzichtig op een sucrosekussen te layeren. Voeg hiervoor 4 mL 20% sucrose (in 1x PBS) toe aan de buis, gevolgd door ~20 - 25 mL van de virale oplossing per buis. Als de buizen voor minder dan driekwart vol zijn, vul dan aan met steriel 1x PBS.
6. Balanceer de monsters zorgvuldig en centrifugeer ze bij 70.000 x g gedurende 2 u bij 17 °C, zoals voorheen. Giet het supernatant af en laat de resterende vloeistof weglopen door de buizen ondersteboven op papieren handdoeken te plaatsen.
7. Aspireer de resterende druppels om alle vloeistof uit het pellet te verwijderen. In deze stap moeten de virusbevattende pellets nauwelijks zichtbaar zijn als kleine doorschijnende vlekjes.
8. Resuspendeer de pellets door 70 µL 1x PBS aan de eerste buis toe te voegen en de suspensie grondig te pipetteren, waarna de suspensie naar de volgende buis wordt overgebracht en zoals voorheen wordt gemengd, totdat alle pellets zijn geresuspendeerd.
9. Spoel de buizen met nog eens 50 µL koud 1x PBS en meng zoals voorheen. Zorg dat het gecombineerde volume van de uiteindige suspensie ~120 µL is en er licht melkachtig uitziet; maak deze helder door centrifugatie bij 10.000 x g gedurende 30 s in een tabletop-microcentrifuge.
10. Breng het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis, maak aliquots van 10 µL en bewaar deze bij -80 °C.
    OPMERKING: Vermijd herhaalde vries-dooi-cycli van de lentivirale monsters. Tenzij centrifugatie vereist is, dient men te streven ernaar de resterende stappen uit te voeren in weefselkweekkappen of aangewezen weefselkweekruimtes met gebruik van passende biosafety-maatregelen

Resultaten

Figuur 1: Concentratie van virale deeltjes met behulp van het double-sucrose gradiëntprotocol. Virale deeltjes verzameld uit het supernatant (SN) worden geladen op een sucrosegradiënt. Voor het maken van de gradiënt worden sucrose-oplossingen van 70%, 60%, 30% en 20% gebruikt. Na centrifugatie worden de deeltjes die zijn verzameld uit de 30-60% sucrosefracties vervolgens geladen op een sucrosekussen van 20% en geprecipiteerd. De uiteindelijke pellet met gezuiverde virale deeltjes wordt geresuspendeerd in 1x PBS voor verder gebruik.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Apparatuur
Optima XPN-80 ultracentrifuge	Beckman Coulter	A99839
Allegra 25R tafelcentrifuge	Beckman Coulter	369434
Ultracentrifugebuisjes met kegelvormige bodem	Seton Scientific	5067
Adapters voor conische buizen	Seton Scientific	PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor	Beckman Coulter	369650
conische centrifugebuizen van 50 mL	Corning	430291
Weefselkweekpipetten, 25 mL	Corning	4489