Bepaling van de lentivirale titer met een enzyme-linked immunosorbent assay

Samenvatting

Bron: Vijayraghavan, S., et al. Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).

Deze video demonstreert het gebruik van een p24 ELISA om virale titers van lentivirale vectoren te schatten. De assay omvat het lyseren van virale deeltjes om p24 vrij te maken, het vastleggen hiervan met specifieke antilichamen en het detecteren hiervan met een peroxidase-gekoppeld systeem dat een meetbare kleurverandering teweegbrengt. Door de absorbantiewaarden van de monsters te vergelijken met een standaardcurve wordt de virale titer gekwantificeerd.

Protocol

1. Bepaling van virale titers

1. p24 (Human Immunodeficiency Virus (HIV)-1 p24 capsid protein) - enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) methode OPMERKING: De assay wordt uitgevoerd met high-binding 96-wells platen volgens de instructies van het NIH AIDS Vaccine Program voor de HIV-1 p24 Antigen Capture Assay Kit (zie Tabel met materialen) met modificaties.
   1. Was de volgende dag de wells drie keer met 20 µL 0,05% Tween 20 in koude PBS (PBS-T oplossing). Coat de plaat met 10 µL monoklonaal anti-p24 antilichaam in een verdunning van 1:1500 in 1x PBS en incubeer dit overnight bij 4 °C.
   2. Om aspecifieke binding te elimineren, wordt de plaat geblokkeerd met 20 µL 1% BSA in PBS; was drie keer met 20 µL 0,05% Tween 20 in koude PBS (PBS-T oplossing) gedurende ten minste 1 u bij kamertemperatuur.
   3. Monsters voorbereiden: Verdun voor geconcentreerde vectorpreparaten 1 µL van het monster 10-voudig door 89 µL dd-H20 en 10 µL Triton X-100 (eindconcentratie van 10%) toe te voegen. Bereid voor niet-geconcentreerde preparaten tien-voudig verdunde monsters (voeg 80 µL dd-H20 en 10 µL Triton X-10 (eindconcentratie van 10%) toe aan 10 µL van het monster). OPMERKING: Monsters kunnen in deze stap gedurende een langere periode bij -20 °C bewaard worden voor later gebruik.
   4. Bereid HIV-1 standaarden door een 2-voudige seriële verdunning uit te voeren (met een startconcentratie van 5 ng/mL).
   5. Verdun geconcentreerde monsters (vanuit 1:10 vooraf verdunde stocks) in RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640 medium) aangevuld met 0,2% Tween 20 en 1% BSA om verdunningen van 1:10.0, 1:50.00 en 1:250.0 te verkrijgen. Verdun niet-geconcentreerde monsters (vanuit 1:10 vooraf verdunde stocks) in RPMI 1640 aangevuld met 0,2% Tween 20 en 1% BSA om verdunningen van 1:50, 1:250 en 1:12.50 te verkrijgen.
   6. Breng de monsters in triplikaat aan op de plaat en incubeer overnight bij 4 °C.
   7. Was de volgende dag de wells zes keer en incubeer bij 37 °C gedurende 4 u met 10 µL polyklonaal konijn anti-p24 antilichaam, verdund 1:10 in RPMI 1640, 10% FBS, 0,25% BSA en 2% normaal muisserum (NMS).
   8. Was zes keer zoals hierboven beschreven en incubeer bij 37 °C gedurende 1 u met geiten anti-konijn horseradish peroxidase IgG, verdund 1:10.00 in RPMI 1640 aangevuld met 5% normaal geitenserum, 2% NMS, 0,25% BSA en 0,01% Tween 20.
   9. Was de plaat, zoals hierboven, en incubeer met TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine) peroxidase substraat bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
   10. Stop de reactie door 100 µL 1 N HCL toe te voegen. Meet de absorptie van het monster bij 450 nm met een absorptieplaatlezer.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagentia voor p24 ELISA
Monoklonaal anti-p24-antilichaam	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3537
HIV-1-standaarden	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP968F
Polyklonaal konijn anti-p24 antilichaam	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP451T
Geiten anti-konijn mierikzalfperoxidase-IgG	Sigma Aldrich	12-348	Werkconcentratie 1:150
Normaal muizenserum, steriel, 50 ml	Equitech-Bio	SM30-050
Geiten serum, steriel, 10 ml	Sigma	G9023	Werkconcentratie 1:10
TMB-peroxidesubstraat	KPL	5120-0076	Werkconcentratie 1:10.0