Genereren van recombinant adeno-geassocieerd virus via plasmidetransfectie

Samenvatting

Bron: Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (2016)

Deze video demonstreert de productie van recombinante adeno-geassocieerde viruspartikels via plasmidtransfectie in zoogdiercellen. Er wordt ingezoomd op de gecoördineerde expressie van Rep-, Cap- en helperproteïnen die de replicatie van het virale genoom en de assemblage van de capside in de nucleus aansturen.

Protocol

1. Transfectie van HEK293-cellen met recombinant adeno-geassocieerd virus 9 (rAAV9)-plasmiden

1. Bereid een 1 µg/µl lineaire polyethylenimine (PEI)-oplossing voor. Los PEI-poeder op in endotoxine-vrij dH₂O dat is verhit tot 70-80 °C. Neutraliseer de oplossing na afkoeling tot RT naar pH 7,0 met 1 M HCl. Steriliseer de oplossing door filtratie (0,2 µm). Verdeel de 1 µg/µl PEI-stockoplossing in aliquoten (1.40 µl/buisje) en bewaar de oplossing bij -20 °C.
2. Kweek HEK293-cellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal kalfsserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine. Kweek de cellen in een incubator bij 37 °C met 5 ± 0,5% kooldioxide (CO₂).
3. Plate op dag 0 de HEK293-cellen in tien 150-mm schalen 18-20 uur voor transfectie door > 90% conflueente cellen in een 1:2 verdunning te splitsen.
   OPMERKING: Op dag 1 moeten de cellen een confluentie van 90% hebben bereikt.
4. Transfecteer op dag 1 de HEK293-cellen met het rAAV9-plasmide (bijv. rAAV9.cTNT::GFP of rAAV6.U6::shRNA constructen), het Ad-Helper-plasmide en het AAV-Rep/Cap-plasmide met behulp van PEI.
   1. Meng voor 10 schalen cellen met 90% confluentie 70 µg AAV-Rep/Cap-plasmide, 70 µg rAAV9-plasmide en 20 µg Ad-Helper-plasmide in een centrifugebuis van 50 ml.
   2. Pas de DNA-hoeveelheid proportioneel aan als de cellen minder confluent zijn. Als de cellen bijvoorbeeld 75% confluent zijn, verminder dan de DNA-hoeveelheid proportioneel (75/90 van de hoeveelheid vermeld in stap 1.4.1): meng 70 x 75/90 = 58,3 µg AAV-Rep/Cap-plasmide, 70 x 75/90 = 58,3 µg rAAV9-plasmide en 20 x 75/90 = 16,7 µg Ad-Helper-plasmide in een centrifugebuis van 50 ml.
   3. Voeg 49 ml RT DMEM (zonder FBS) toe aan de buis van 50 ml en meng goed.
   4. Voeg 1.360 µl PEI-oplossing toe zodat de PEI:DNA-ratio (v/w) 4:1 bedraagt. Meng goed. Incubeer bij RT gedurende 15 - 30 min.
   5. Voeg 5 ml van het mengsel dat in stap 1.4.4 is bereid toe aan elke 150-mm schaal (50 ml van het mengsel voor tien 150-mm schalen).
5. Kweek de cellen in een incubator bij 37 °C met 5 ± 0,5% CO₂ gedurende 60-72 uur.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Polyethylenimine, lineair (MW 25.0)	Polysciences, Inc.	#2396-2
Buis, polypropyleen, 36,2 ml, 25 x 87 mm, (aantal 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
DMEM-medium	Fisher Scientific	SH30243FS
Foetaal runderserum	Atlanta Biologicals	S150
rAAV9-vector	Penn Vector Core	P1967