Zuivering van recombinante viruspartikels uit getransfecteerde menselijke niercellen

Samenvatting

Bron: Ding, J. et. al., Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (2016)

Deze video laat de zuivering van recombinante viruspartikels uit getransfecteerde menselijke niercellen zien. Het virus wordt vrijgegeven door vries-dooi-lyse en gezuiverd met behulp van iodixanolgradiënten met blokcopolymeer-ondersteunde filtratie.

Protocol

1. Transfectie van HEK293-cellen met recombinant adeno-geassocieerd virus 9 (rAAV9) plasmiden
   1. Bereid een 1 µg/µl oplossing van lineair polyethylenimine (PEI). Los PEI-poeder op in endotoxinevrij dH₂O dat is verhit tot 70-80 °C. Nadat de oplossing is afgekoeld tot kamertemperatuur (RT), wordt de oplossing geneutraliseerd tot pH 7,0 met 1 M zoutzuur (HCl). Steriliseer de oplossing door filtratie (0,22 µm). Verdeel de 1 µg/µl PEI-stockoplossing in aliquoten (1.400 µl/buisje) en bewaar de oplossing bij -20 °C.
   2. Kweek HEK293-cellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal kalfsserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine. Kweek de cellen in een incubator van 37 °C met 5 ± 0,5% koolstofdioxide (CO₂).
   3. Op dag 0 worden de HEK293-cellen 18-20 uur voor transfectie in tien 150-mm schalen geplaat door > 90% confluente cellen in een 1:2 verdunning te splitsen.
      OPMERKING: Op dag 1 moeten de cellen een confluentie van 90% hebben bereikt.
   4. Op dag 1 worden de HEK293-cellen getransfecteerd met het rAAV9-plasmide (bijv. rAAV9.cTNT::GFP of rAAV6.U6::shRNA constructen), het Ad-Helper-plasmide en het AAV-Rep/Cap-plasmide met behulp van PEI.
      1. Meng voor 10 schalen met cellen bij 90% confluentie 70 µg AAV-Rep/Cap-plasmide, 70 µg pfrAAV9-plasmide en 200 µg Ad-helper-plasmide in een 50-ml centrifugebuis.
      2. Als de cellen minder confluent zijn, pas dan de DNA-hoeveelheid proportioneel aan. Als de cellen bijvoorbeeld 75% confluent zijn, verminder dan de DNA-hoeveelheid proportioneel (75/90 van de hoeveelheid vermeld in stap 2.4.1): meng 70 x 75/90 = 58,3 µg AAV-Rep/Cap-plasmide, 70 x 75/90 = 58,3 µg rAAV9-plasmide en 200 x 75/90 = 166,7 µg Ad-Helper-plasmide in een 50-ml centrifugebuis.
      3. Voeg 49 ml RT DMEM (zonder FBS) toe aan de 50-ml buis en meng goed.
      4. Voeg 1.360 µl PEI-oplossing toe om een PEI:DNA ratio (v/w) van 4:1 te verkrijgen. Meng goed. Incubeer bij RT gedurende 15 - 30 min.
      5. Voeg 5 ml van het in stap 1.4.4 bereide mengsel toe aan elke 150-mm schaal (50 ml van het mengsel voor tien 150-mm schalen).
   5. Kweek de cellen in een incubator van 37 °C met 5 ± 0,5% CO₂ gedurende 60-72 uur.
2. Oogsten van getransfecteerde HEK293-cellen en zuivering van rAAV9-vectoren
   1. Oogst de cellen 60-72 uur na transfectie. Los de cellen in de schalen en suspendeer ze door met het kweekmedium op en neer te pipetteren. Breng alle cel-suspensies over naar steriele 50-ml buisjes.
   2. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 min. Resuspendeer de celpellet met 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in elk buisje en voeg alle cel-suspensies samen in één 50 ml buis.
   3. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant. Bewaar in deze stap de celpellet bij -80 °C of zuiver het AAV onmiddellijk uit de pellet, zoals beschreven in stappen 2.4-2.15.
   4. Bereid de lysisbuffer: 150 mM natriumchloride (NaCl) en 20 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethaan hydrochloride (Tris-HCl, pH 8,0). Steriliseer door filtratie (0,22 µM). Bewaar de buffer bij 4 °C.
   5. Resuspendeer de pellet met 10 ml lysisbuffer.
   6. Bevries het lysaat bij -80 °C of in een droogijs/ethanolbad en ontdooi het vervolgens bij 37 °C. Vortex gedurende 1 min. Bevries en ontdooi het lysaat 3 keer.
   7. Voeg magnesiumchloride (MgCl₂) oplossing toe aan het ontdooide lysaat (zodat de uiteindelijke concentratie MgCl₂ in het lysaat 1 mM is). Voeg nuclease toe tot een uiteindelijke concentratie van 250 U/ml. Incubeer bij 37 °C gedurende 15 min om DNA/proteïne-aggregaten op te lossen.
      OPMERKING: Als DNA/proteïne-aggregaten na behandeling met nuclease of endonuclease niet zijn opgelost, homogeniseer de lysaten dan 20 keer met een dounce-homogenisator.
   8. Centrifugeer het monster bij 4.800 x g gedurende 20 min bij 4 °C. Verzamel het supernatant.
   9. Bereid ondertussen de Iodixanol-gradiëntoplossing:
      1. Bereid de 17% gradiëntoplossing door 5 ml 10x PBS, 0,05 ml 1 M MgCl₂, 0,125 ml 1 M kaliumchloride (KCl), 10 ml 5 M NaCl en 12,5 ml dichtheidsgradiëntmedium te mengen. Vul het totale volume aan tot 50 ml met H₂O.
      2. Bereid de 25% oplossing door 5 ml 10x PBS, 0,05 ml 1 M MgCl₂, 0,125 ml 1 M KCl, 20 ml dichtheidsgradiëntmedium en 0,2 ml 0,5% (w/v) Fenolrood te mengen. Vul het totale volume aan tot 50 ml met H₂O.
      3. Bereid de 40% oplossing door 5 ml 10x PBS, 0,05 ml 1 M MgCl₂, 0,125 ml 1 M KCl en 33,3 ml dichtheidsgradiëntmedium te mengen. Vul het totale volume aan tot 50 ml met H₂O.
      4. Bereid de 60% oplossing door 0,05 ml 1 M MgCl₂, 0,125 ml 1 M KCl, 50 ml dichtheidsgradiëntmedium en 0,1 ml 0,5% (w/v) Fenolrood te mengen.
   10. Laad de Iodixanol-gradiëntoplossing met een naald en spuit in de polypropyleenbuis in de volgorde van 5 ml 17%, 5 ml 25%, 5 ml 40% en 5 ml 60%, beginnend vanaf de bodem. Laad al het in stap 3.8 verkregen lysaat (14-16 ml) bovenop de gradiënt. De gradiënt, van onder naar boven vermeld, is 60%, 40%, 25%, 17% en de lysaatlaag. Vul de buis met lysisbuffer en sluit deze af met de stop.
   11. Centrifugeer bij 185.000 x g gedurende 90 min bij 16 °C.
   12. Oogst de virale fractie (40% laag) met een spuit. Steek de naald (21 gauge) in de overgang tussen de 40% en 60% fracties en aspireer alleen de 40% laag.
       OPMERKING: Vermijd het aspireren van de 25% laag.
   13. Meng de virale fractie met een gesteriliseerde polyoxyethyleen-polyoxypropyleen blokcopolymeer PBS-oplossing (10% polyoxyethyleen-polyoxypropyleen blokcopolymeer stock 1:10.000 verdund in PBS) tot een totaal volume van 15 ml. Laad het mengsel in de filterbuis (cut-off MW = 100 kD). Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 30 min bij 4 °C.
   14. Verwijder de oplossing aan de onderzijde. Vul de filterbuis opnieuw met polyoxyethyleen-polyoxypropyleen blokcopolymeer PBS-oplossing tot een totaal volume van 15 ml. Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 20 min bij 4 °C. Herhaal deze stap nog twee keer. Verzamel het gezuiverde rAAV9-virus (de fractie boven het filter).
   15. Breng het gezuiverde rAAV9 in de filterbuis over naar 1,7-ml buisjes. Verdeel het gezuiverde rAAV9 in aliquoten (100 - 400 µl/buisje, afhankelijk van het volume en de titer van het AAV) en bewaar het virus bij -80 °C.
       OPMERKING: Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Polyethylenimine, lineair (MW 25,000)	Polysciences, Inc.	#23966-2
Buis, polypropyleen, 36.2 ml, 25 x 87 mm, (aantal 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
Nuclease, ultrapuur	SIGMA	#E8263-25KU
Dichtheidsgradiëntmedium (Iodixanol)	SIGMA	#D1556-250ML
Centrifugale filtereenheid met Ultracel-100 membraan	EMD Millipore Corporation	#UFC910008
Laboratoriumpipetteernaald met stompe uiteinden van 90°, gauge 14, L 6 in., vernikkelde hub	SIGMA	#CAD7942-12EA
Poloxameer 188 oplossing (Pluronic® F-68 oplossing)	SIGMA	P5556-100ML
Proteïnase K	SIGMA	3115828001
DNase I	Roche	10104159001
Centrifuge	Thermo Scientific	75004260
Centrifugesysteem	Beckman Coulter	363118
Ultracentrifuge	Beckman Coulter
DMEM medium	Fisher Scientific	SH30243FS
Foetaal runderserum	Atlanta Biologicals	S11150
rAAV9 vector	Penn Vector Core	P1967