Immortalisering van endotheelcellen via retrovirale transductie van virale oncogenen

Samenvatting

Bron: McAllister, S. C., Hanson, R. S., et al. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp.(2017)

Deze video demonstreert de retrovirale transductie van primaire endotheelcellen met HPV16 E6/E7-oncogenen. De geïntegreerde oncogenen inactiveren de tumorsuppressoren p53 en Rb, waardoor de levensduur van de cellen wordt verlengd. Selectie met G418 verrijkt de populatie met getransduceerde cellen, wat resulteert in geïmmortaliseerde endotheelculturen die geschikt zijn voor transformatiestudies

Protocol

Transductie van endotheelcellen (EC) met E6- en E7-papillomavirusgenen

OPMERKING: Wij gebruiken routinematig standaard weefselkweekflessen voor het kweken van primaire EC. Indien echter onvoldoende groei van EC wordt waargenomen, dient het gebruik van commerciële kweekflessen te worden overwogen.

1. Kweek primaire humane dermale microvasculaire of lymfatische EC in een bevochtigde incubator bij 37 °C plus 5% CO₂ in EC-groeimedium (EGM; bevat EC-basaalmedium [EBM] aangevuld met EGM-2 BulletKit [bevattende foetaal runderserum, hydrocortison, humane fibroblastengroeifactor-B, vasculaire EC-groeifactor, insuline-achtige groeifactor-1, ascorbinezuur, humane epitheliale groeifactor, antibiotica en heparine]) in een T75-celkweekfles tot ongeveer 50% confluentie.
2. Voor transductie worden PA317 LXSN 16E6E7-cellen gekweekt in een bevochtigde incubator bij 37 °C plus 5% CO₂ in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum en antimicrobiële middelen in een T150-celkweekfles tot ze ongeveer 90% confluent zijn. Incubeer deze vervolgens gedurende de nacht in 16 mL medium.
3. Klaar het PA317-medium door te centrifugeren bij 300 × g gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
4. Verwijder het EGM uit de EC-kweek, voeg 12 mL van het geklaarde PA317-medium toe bovenop de cellen en incubeer gedurende 4 u.
   OPMERKING: Het centrifugeren van 16 mL geconditioneerd medium bij 300 × g gedurende 5 min resulteert in een compacte pellet die niet wordt verstoord door het daaropvolgende zorgvuldige verwijderen van 12 mL geklaard supernatant. Indien de overdracht van PA317 LXSN 16E6E7-cellen naar primaire EC-kweken echter een zorg is (de packaging-cellijn zal de EC snel overgroeien), kan filtratie van het geconditioneerde supernatant door een 0,45 µm filter vóór de overdracht worden uitgevoerd.
5. Vervang 6 mL van het PA317-medium door vers EGM en incubeer gedurende de nacht.
6. Voed de EC opnieuw met 12 mL vers EGM en incubeer nog eens 48 u.
7. Om de EC te subcultiveren, wordt het medium verwijderd en worden de cellen gewassen met 12 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder kationen; voeg vervolgens 3 mL commerciële enzymatische dissociatie-oplossing toe (bijv. TrypLE) en incubeer bij 37 °C gedurende 3 min.
8. Breng de celsuspensie over naar een conische buis van 15 mL en centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Resuspendeer de resulterende celpellet in vers EGM en verdeel deze gelijkmatig over 3 × T75-flessen met een eindvolume van 12 mL EGM per fles.
9. Om te selecteren op EC die zijn getransduceerd met E6 en E7, wordt G418 toegevoegd tot een eindconcentratie van 200 µg/mL gedurende twee passages, waarna de getransduceerde EC kunnen worden uitgeplaat voor infectie of bevroren in vloeibare stikstof.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BCBL-1-cellen	NIH AIDS Reagent Program	3233
PA317-cellen	ATCC	CRL-2203
Neonatale dermale microvasculaire endotheelcellen	Lonza	CC-2505
EBM-2 Basal Medium	Lonza	CC-3156
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
RPMI
DMEM
PBS met calcium en magnesium