Visualisatie en groottebepaling van Faustovirus met behulp van elektronenmicroscopie

Samenvatting

Bron: Bou Khalil, J. Y., et al. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016).

Deze video demonstreert de beeldvorming van faustovirusdeeltjes uit een geïnfecteerde amöbenkweek met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie. Er wordt ingegaan op de preparatie van het raster, negatieve kleuring met ammoniummolybdaat om het contrast te verhogen en de visualisatie van het virus onder de microscoop. Het protocol wordt afgesloten met het opmeten van de grootte van het faustovirus met behulp van de geïntegreerde softwaretools van de microscoop.

Protocol

1. Elektronenmicroscopie
   1. Beoordeel na de eerste identificatie op de coupes de aanwezigheid van het reusvirus door elektronenmicroscopische observatie van supernatantculturen.
   2. Breng 5 µl van de positieve sample aan op het glow-discharged grid. Laat dit ongeveer 20 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
   3. Droog het grid voorzichtig en breng een kleine druppel 1% ammoniummolybdaat gedurende 10 sec aan. Laat het grid 5 min drogen.
   4. Voer de elektronenmicroscopie uit bij 20 keV.
   5. Plaats het grid in de houder; breng de houder in de microscoop. Controleer het vacuümoverzicht door op het overeenkomstige icoon te klikken. Sluit de kleppen en begin de observatie bij een spot size 5 en een vergroting van x 25,0.
   6. Meet het reusvirus met ImageJ of direct in de microscoop met de meettool van de microscoop op het acquisitiescherm.
      OPMERKING: Classificeer de sample in de Faustovirus-groep bij een capsidgrootte van ongeveer 20 nm.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Amoebenstam CDC-19	ATCC	Frankrijk	50237
Platen	Cellstar	Frankrijk	65180
Vacuümdreven filters	Thermo scientific	Frankrijk	BPV450 / 2017015
Fosfaatgebufferde zoutoplossing	Thermo Fisher scientific	Frankrijk	1010-023
DAPI-kleuring	Life Technologies	Frankrijk	D1306
Koolstofroosters	Euromedex	Frankrijk	FCF40NI
Ammoniummolybdaat	VWR internationanl	Frankrijk	21276185
Kolven	SARSTEDT	Duitsland	8391
0.2 μm Filters	Milex millipor	Frankrijk	SE2M29104
Ultracentrifuge Sorval WX 80	Thermo scientific	Frankrijk	9102448
Rapid-flow filters	Nalgene	Frankrijk	450-0020