Bepaling van de virale RNA-distributie in gastheercellen via fluorescentie in situ hybridisatie

Samenvatting

Bron: Vallery, T. K. & Steitz, J. A. Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells. J. Vis. Exp. (2019)

Deze video demonstreert fluorescentie in situ hybridisatie om viraal RNA te visualiseren in virusgeïnfecteerde cellen. Er wordt een overzicht gegeven van de stappen die betrokken zijn bij probe-hybridisatie, signaalamplificatie en confocale beeldvorming.

Protocol

1. Fixatie, hybridisatie en visualisatie van virale RNA's

1. Verwijder het medium en overtollige cellen. Gebruik gedurende dit protocol vacuümzuiging om oplossingen te verwijderen en voorzichtig micropipetteren om oplossingen toe te voegen.
   OPMERKING: De sterkte van het vacuüm kan worden verminderd door een micropipetpunt van 20 µL over de glazen Pasteurpipet te plaatsen. Vervang de micropipetpunt tussen de wasstappen om contaminatie te voorkomen. Elke wasstap moet snel worden uitgevoerd, omdat het essentieel is dat de cellen nooit uitdrogen.
2. Fixeer de cellen onmiddellijk met vorgekoelde 4% formaldehyd/PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) gedurende 30 min op ijs. Was de cellen drie keer met 20 µL 1x PBS gekoeld tot 4 °C en incubeer 5 min bij kamertemperatuur of op ijs.
   1. Permeabiliseer de gefixeerde cellen met 20 µL vorgekoelde 0,5% Triton-X/PBS gedurende 10 min op ijs of met 750 µL vorgekoelde 70% ethanol bij 4 °C gedurende 1 u (min) tot 7 d (max).
      OPMERKING: Alle wasbeurten in dit protocol worden op dezelfde manier uitgevoerd, tenzij anders aangegeven. 70% ethanol weekt de lijm tussen de kamers en het objectglas los, wat de latere scheiding vergemakkelijkt, en biedt tevens een aanzienlijke onderbreking in het protocol. Gebruik niettemin paraffinefolie rond het kamer-objectglas om verdamping te verminderen en controleer ongeveer elke 8 u het niveau van de ethanol in elke kamer. 70% ethanol vlakt de cellen ook af, wat een scherper beeld oplevert, terwijl Triton-X de cellen niet dehydrateert en de dimensies van de cel niet verandert.
3. Verwijder de kamers voorzichtig om te voorkomen dat het objectglas breekt.
   OPMERKING: Gebruik een nieuw verwijderingsinstrument of een instrument met zeer weinig resterende kleefstof van de fabrikant, en verwijder de kamers voorzichtig om te voorkomen dat het objectglas breekt. Het gebruik van 70% ethanol als permeabiliseringsreagens gedurende 4 u vermindert de kans op breuk aanzienlijk. In geval van een breuk kan het protocol worden voortgezet op kamers die niet door de breuk zijn aangetast; houd hierbij rekening met de hogere oxidatiesnelheid van imperfect afgesloten objectglazen (d.w.z. een kortere bewaartermijn).
4. Was de cellen één keer met 2x SSC (saline sodium citrate) en breng vervolgens 45 µL hybridisatie-oplossing aan, bestaande uit 50% formamide, 10% dextraansulfaat, 2x SSC, 0,1% runder serumalbumine (BSA), 500 µg/mL deoxyribonuclezuur (DNA) van zalmlakse sperma, 125 µg/mL E. coli transfer-RNA (tRNA) en 1 mM vanadylribonucleosidecomplexen. Incubeer 1 u bij 37 °C in een bevochtigingskamer, wat een Petrischaal van 150 mm met bevochtigde steriele doekjes kan zijn.
   OPMERKING: Bereid de verse hybridisatie-oplossing ten minste een uur voor gebruik. Los het dextraansulfaat eerst op in water, door regelmatig te vortexen en te incuberen in een waterbad van 37 °C.
5. Bereken de hoeveelheid oligonucleotiden die nodig is om de gesuggereerde concentratie van 25 µM in 35 µL hybridisatie-oplossing per kamer te bereiken. Pas de concentratie van het anti-sense oligonucleotide naar behoefte aan. Voeg gedestilleerd water toe aan de oligonucleotiden om het denaturatievolume op 10 µL te brengen.
   OPMERKING: Na de labelingsreactie worden de oligonucleotiden bewaard in de quenched-oplossing die 0,18 M kaliumcacodylaat, 23 mM Tris-HCl, 0,23 mg/mL BSA, 4,5 mM CoCl₂, 18 mM ethylenediaminetetra-azijnzuur (EDTA), 2,7 mM kaliumfosfaat, 6,8 mM KCl, 45 µM 2-mercaptoethanol, 0,02% Triton X-10 en 2% glycerol bevat. De concentraties zijn hoog genoeg zodat verdunning met water de denaturatie-oplossing brengt naar concentraties nabij 1x TE (10 mM Tris-HCl en 1 mM EDTA), een standaard denaturatiebuffer voor oligonucleotiden.
6. Denatureer de digoxigenine (DIG)- en/of Alexa Fluor 594-gelabelde oligonucleotiden bij 95 °C gedurende 5 min. Voeg vervolgens 35 µL verse hybridisatie-oplossing per beoogde kamer toe aan de gedenatureerde oligonucleotiden. Bij het uitvoeren van dubbele fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) kunnen beide sets anti-sense oligonucleotiden samen worden gedenatureerd en gehybridiseerd.
7. Verwijder de pre-hybridisatie-oplossing en voeg vervolgens de hybridisatie-oplossing met de gelabelde oligonucleotiden toe aan de cellen. Incubeer overnacht in de bevochtigingskamer bij 37 °C, afgedekt met aluminiumfolie om de fluorofoor-gelabelde oligonucleotiden te beschermen.
   OPMERKING: De incubatie moet minimaal 10 u en maximaal 24 u duren.
8. Was de volgende dag de cellen twee keer met 2x SSC gedurende 10 min bij 37 °C en vervolgens twee keer met 1x SSC gedurende 10 min bij 25 °C.
9. Fixeer de cellen met vorgekoelde 4% formaldehyd/1x PBS gedurende 10-15 min op ijs. Was de cellen vervolgens drie keer met PBS en permeabiliseer gedurende 1 u met vorgekoelde 70% ethanol of gedurende 10 min met vorgekoelde 0,5% Triton-X/1x PBS bij 4 °C.
10. Incubeer de cellen met 1:20 anti-digoxigenine (DIG)–fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) in vorgekoelde 0,1% BSA/1x PBS gedurende 1 u bij 4 °C. Verwijder de antilichaamoplossing en was drie keer met 1x PBS.
11. Fixeer met vorgekoelde 4% formaldehyd/1x PBS gedurende 10-15 min bij 4 °C en was vervolgens drie keer met 1x PBS.
12. Incubeer de cellen met 0,4 µg/mL 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in vorgekoelde 0,5% Triton-X/1x PBS gedurende 15 min op ijs en was vervolgens drie keer met 1x PBS.
13. Monteer de objectglazen met fluorescentiekralen (optioneel) en een monteermedium. Zet vervolgens het dekglas vast op het objectglas met transparante nagellak.
14. Verzamel met een confocale microscoop beelden van de monsters binnen een uur tot een week na uitvoering van het protocol bij een vergroting van 630x. Breng meerdere lagen nagellak aan om het dekglas af te sluiten en de levensduur van de fluorofoor te verlengen door de oxidatiesnelheid te verlagen.
    OPMERKING: Gebruik geen monteermedium dat DAPI bevat. Voeg bij het verzamelen van de beelden een schaalbalk toe aan elk beeld voor latere kwantificatie. Fluorescentiekralen dienen als controles voor de fluorescentie-intensiteit tussen objectglazen en monsterpreparaten. Neem beelden op bij het middenvlak van de cel voor tweedimensionale (2D) kwantificatie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-DIG FITC	Jackson Lab Immunologicals	20-092-156
Dextransulfaat	Sigma Aldrich	D8906	Moleculaire biologie kwaliteit
DIG-oligonucleotide tailing kit	Sigma Roche	#0353583910	2e generatie
Achtkamerslides	Nunc Lab Tek II	#15453	Blue seal bevordert de oppervlaktespanning, maar scheiding door heldere gel is ook beschikbaar.
Formamide	Sigma Aldrich	F9037	Moleculaire biologie kwaliteit
Vanadylribonucleoside-complexen	NEB	S1402S