Het meten van spontane faaginductie in lysogene bacteriën in de loop van de tijd

Samenvatting

Bron: Krishnamurthi, R., et al. Understanding the Impact of Temperate Bacteriophages on Their Lysogens Through Transcriptomics. J. Vis. Exp. (2024).

Deze video demonstreert de temporele enumeratie van spontane fageninductie in lysogene Pseudomonas aeruginosa door het kwantificeren van levensvatbare bacteriële cellen (CFU's) en infectieuze fagenpartikels (PFU's) over tijd. Door monstername op vaste intervallen tijdens de groei en het analyseren van zowel kolonie- als plaquevorming, onthult deze methode wanneer de spontane inductie minimaal is. Dit maakt de identificatie mogelijk van optimale tijdstippen voor downstream transcriptomische analyse met minimale lytische interferentie.

Protocol

1. Temporele directe enumeratie van spontane inductie (Figuur 1)

1. Stel overnight-startculturen op van zowel de lysogeen (bijv. P. aeruginosa PAO1-lysogeen met LES-fagen (Liverpool Epidemic Strain (LES) bacteriofagen)) als de indicatorgastheer (PAO1-Rif^R) (rifampicine-resistente Pseudomonas aeruginosa PAO1) door een enkele kolonie te inoculeren in 5 mL LB (Luria–Bertani-bouillon), en te incuberen bij 37 °C onder schudding bij 180 rpm (18–24 u).
2. Stel verse lysogeen- en indicatorgastculturen op door de overnightculturen in 100 mL LB te inoculeren in een verhouding van 1:100, en incubeer bij 37 °C met schudden (180 rpm).
   1. Monitor de groei van de lysogeen door de OD te meten₆₀₀ en de levensvatbare telling met behulp van de Miles Misra-techniek. Neem hiervoor vanaf het moment van inoculatie gedurende 8 uur elk uur een monster van 1 mL van elke lysogeencultuur.
   2. Verdun het monster onmiddellijk na afname serieel door toe te voegen 100 µL van de monster in 900 µL van het betreffende medium. Vortex grondig op maximale snelheid, vervang de tip bij elke verdunning en zet de verdunningsreeks voort van 10⁻¹ tot 10⁻⁹.
   3. Pipetteer 10 µL van de vereiste verdunningen in triplikaat op een LB-agarplaat, laat dit drogen en incubeer bij 37 °C gedurende 18–24 u.

   4. Om het aantal levensvatbare bacteriële cellen te berekenen, wordt een verdunning gezocht met gemakkelijk telbare kolonies. Tel het aantal kolonies in elke spot en gebruik vervolgens de volgende formule:
       

      

      
      OPMERKING: Naarmate de lysogene cultuur groeit, zullen actieve faagdeeltjes worden geproduceerd door spontane inductie. De productie van infectieuze fagen betekent dat het transcriptoom van de lysogene populatie nu besmet is met genexpressie geassocieerd met de lytische replicatiecyclus, afkomstig van het lytische faagreplicatiesignaal en de corresponderende respons van de gastheercel. Het is daarom belangrijk om het groeistadium te identificeren waarin de verhouding tussen lysogene cellen en vrije infectieuze faagdeeltjes het hoogst is, om zoveel mogelijk achtergrondruis in de transcriptie (gegenereerd door het lytische faagtranscriptoom) in de dataset te beperken.

3. Om de infectieuze fagepartikels in elk tijdsgebonden monster te tellen, inoculeert u 5 mL steriele 0,4% bacteriologische agar in LB (topagar) met 100 µL van indicatorgastheer in de midden-exponentiële fase (OD600: 0,4–0,5; in dit geval PAO1-Rif^R) in aanwezigheid van een geschikt selectiemiddel (50 µg·mL⁻¹ rifampicine in dit geval, aangezien de MIC van de PAO1-gast slechts 16 µg·mL⁻¹)
   1. Pipetteer op 10 µL van dezelfde seriële verdunning (zie stap 1.2.2) op de geïnoculeerde topagarlaag en laat dit drogen vóór incubatie bij 37 °C gedurende 18–24 u.

   2. Om het aantal infectieuze fagepartikels te berekenen, selecteert u een verdunning met gemakkelijk telbare plaques. Tel het aantal plaques in elke spot.
       

      

   3. Bepaal het tijdstip/de conditie waarbij de spontane inductie per CFU (colony forming unit) minimaal is voor de verdere experimentele stappen.

Resultaten

Figuur 1: Het experimentele ontwerp voor het tellen van de PFU en CFU van een lysogeen uit hetzelfde monster.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
PAO1		6
LESB58		6
LES-fagen	Geïnduceerd en gezuiverd uit LESB58 met gebruik van norfloxacine.
Lysogeny Broth (LB)	Merck	1.10285.500
LB Agar	Merck	1.10283.500
Agar-agar	Fisher	A/1080/53
Top agar	0,4 g agar-agar + 2,5 g LB-bouillon in 100 mL water; autoclaveren en gebruiken.	-
Rifampicine	Sigma (Voorraad: 50 mg/mL in methanol - goed mengen en een 0,22 µm filter gebruiken voor sterilisatie; bewaren bij -20 °C tot gebruik)	R3501